5-氟尿嘧啶联合重组人细胞珠蛋白治疗缺氧诱导化疗耐受肝细胞癌的体外实验

目的探讨联合使用重组人细胞珠蛋白(rhCYGB)靶向缺氧诱导的5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗耐受在肝癌中的作用及机制。以期为改善难治性肝癌提供一种新的联合治疗策略。方法在常氧和缺氧条件下检测不同药物对肝癌细胞的半数抑制率并绘制量效曲线,评估不同氧浓度下肝癌细胞对5-FU的敏感性。使用CompuSyn和SynergyFinder 3.0软件分析不同浓度rhCYGB和5-FU在常氧和缺氧条件下处理肝癌细胞的联合效应。肿瘤干细胞成球实验评估联合用药对肝癌干细胞性的作用。流式细胞术检测联合用药对CD133阳性细胞亚群比例的影响。划痕实验评估联合用药对肝癌细胞迁移的影响。结果缺氧条件下5-FU处理Hep3B、Huh7和HepG2细胞IC50值显著高于常氧条件下IC50值(P<0.05),分别为常氧条件下的15.27、4.25、2.34倍。常氧和缺氧条件下5-FU联合rhCYGB具有协同效应。与5-FU单药组相比,5-FU联合rhCYGB对肝癌干细胞球的形成具有抑制作用(P<0.05),且可显著下调Hep3B细胞中CD133阳性亚群比例(P<0.05)。常氧条件下rhCYGB联合5-FU处理48 h后对Hep3B细胞的迁移具有联合抑制作用(P<0.05)。结论rhCYGB与5-FU联合运用在肝癌中具有协同效应;联合机制可能涉及干细胞性及细胞迁移能力的调控。

重组细胞因子基因衍生蛋白与干扰素α-2b分别联合恩替卡韦治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者疗效研究

目的观察比较应用重组细胞因子基因衍生蛋白或干扰素α-2b分别联合恩替卡韦治疗血清HBeAg阳性的慢性乙型肝炎(CHB)患者的疗效.方法2019年3月~2021年3月我院诊治的65例血清HBeAg阳性的CHB患者被分成两组,分别给予干扰素α-2b联合恩替卡韦治疗或重组细胞因子基因衍生蛋白联合恩替卡韦治疗48 w.常规检测血清生化学、血清学和病毒学指标.结果在治疗12 w末,恩替卡韦联合重组细胞因子基因衍生蛋白治疗组血清HBeAg转阴率和HBeAg血清转换率分别为34.4%和25.0%,均显著高于恩替卡韦联合干扰素α-2b治疗组的9.1%和6.1%,差异有统计学意义(P<0.05);在治疗48 w末,恩替卡韦联合重组细胞因子基因衍生蛋白治疗组血清ALT复常率、血清HBeAg转阴率和HBeAg血清转换率分别为87.5%、62.5%和40.6%,均显著高于恩替卡韦联合干扰素α-2b治疗组的78.8%、30.3%和18.2%,差异有统计学意义(P<0.05);在治疗期间,联合干扰素治疗组乏力和发热头痛发生率分别为21.2%和84.9%,显著高于联合衍生蛋白治疗组的3.1%和3.1%(P<0.05),而两组中性粒细胞减少、血小板减少、食欲下降和低钙血症等不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05).结论相比于干扰素α-2b联合恩替卡韦,应用重组细胞因子基因衍生蛋白联合恩替卡韦治疗血清HBeAg阳性的CHB患者能够获得更好的血清学转换率和较小的不良反应,值得进一步观察研究.

重组大鼠细胞球蛋白的制备、纯化与活性

通过聚合酶链式反应(PCR)克隆鼠源细胞球蛋白(Cytoglobin,CYGB)基因,构建原核表达载体pET22b-Cygb,转入E.coliBL21(DE3)经乳糖诱导表达CYGB,发现CYGB主要以可溶形式存在,其表达量占可溶性总蛋白的35%以上.通过DEAE阴离子交换柱层析和Sephacryl S-100凝胶过滤层析,CYGB纯度可超过95%.重组表达的可溶性CYGB不但具有过氧化物酶活性,其活性为(3.23±0.12)mkat.(g.min)-1,还能保护胎鼠原代皮肤成纤维细胞减轻氧化应激损伤(H2O2模型).

口蹄疫3D蛋白N端T细胞表位重组蛋白的表达、纯化及鉴定

为获得具有抗原性的口蹄疫病毒(FMDV)3D蛋白N端T细胞表位的重组表达蛋白,根据FMDV3D蛋白前115位氨基酸序列,设计优化并人工合成相应的核酸序列,将其克隆至pET-28a中,构建原核表达质粒pET28a-115,并将重组质粒转化至BL21(DE3)细胞。经IPTG诱导后,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-bolt鉴定,结果显示,在16kD处有一条明显的蛋白表达条带。对表达产物进行可溶性分析,结果表达蛋白50%为可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后获得了较高浓度和纯度的目的蛋白。研究结果表明,含FMDV 3D蛋白前115位氨基酸的重组蛋白在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达,并具有较好的抗原活性,为开发口蹄疫诊断试剂和基因工程疫苗奠定了基础。

重组人源肝星状细胞激活相关蛋白体外生物活性的研究

文章表达、纯化了重组人源肝星状细胞激活相关蛋白,研究了其抗氧化的生物活性和对次氮基三乙酸铁造成的大鼠肝星状细胞氧化应激的抑制作用。结果显示重组人源肝星状细胞激活相关蛋白具有抗氧化的生物活性,活性为(80.0±3.0)U/mg;可抑制次氮基三乙酸铁对肝星状细胞造成的氧化应激,具体表现为可以降低丙二醛、羟脯氨酸的含量,提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活力,并且抑制肝星状细胞的增殖。重组人源肝星状细胞激活相关蛋白对肝星状细胞氧化应激的抑制作用具有剂量依赖关系,浓度大于或等于10μg/mg,即有明显的作用。

重组纤维连接蛋白羧基端细胞结合域对骨髓基质干细胞黏附力的影响

目的:研究增强骨髓基质干细胞黏附力的方法。方法:去细胞猪主动脉瓣叶分别用纤维连接蛋白(Fn)和重组纤维连接蛋白羧基端细胞结合域(FnCTD64)及牛血清白蛋白(BSA)浸泡预涂处理12 h,对照组未预涂蛋白。采用间隔24 h、3次种植的方法种植骨髓基质干细胞(BMSCs),于种植后第8天进行细胞计数及MTT法检测比较去细胞瓣叶上黏附、增殖的细胞数量,同时取瓣叶进行组织学检测观察瓣叶表面BMSCs覆盖情况。结果:采用预涂Fn和FnCTD64后的去细胞猪主动脉瓣叶,预涂Fn组的细胞计数为(9.085±0.622)×104,MTT的吸光值为0.537±0.022;预涂FnCTD64组的细胞计数为(9.111±0.607)×104,MTT的吸光值为0.540±0.025;预涂BSA组的细胞计数为(4.593±0.464)×104,MTT的吸光值为0.360±0.018;对照组的细胞计数为(4.460±0.441)×104,MTT的吸光值为0.353±0.019;前两组明显高于后两组(P<0.01)。预涂Fn组和FnCTD64组无显著性差异。瓣叶经H-E染色,可见预涂Fn和FnCTD64组细胞覆盖情况优于预涂BSA组和对照组。结论:Fn和FnCTD64能明显增加BMSCs在去细胞猪主动脉瓣叶表面的黏附和增殖。

人白细胞介素13重组蛋白表达载体的构建及其在大肠埃希菌的表达

目的 构建人白细胞介素 13(rh IL- 13)重组蛋白表达载体 ,热诱导 rh IL- 13在 E.coli DH5 α表达。方法 经巢式 RT- PCR从非粘附贴壁生长的 PBMC活化细胞中克隆 h IL- 13成熟蛋白编码基因 ,随后构建 rh IL13- PBV重组蛋白表达质粒 ,热诱导表达重组蛋白。结果 在 h IL13- PBV/ DH5 α工程菌热诱导全菌蛋白中检测到相对分子质量大小约为 10× 10 3的 h IL- 13重组蛋白 (rh IL- 13蛋白 )。结论 rh IL- 13的表达成功 ,为今后进一步研究 h IL-13的生物学功能 ,探讨其临床应用价值奠定了一定的物质基础。

重组人淋巴细胞功能相关抗原3-抗体融合蛋白质量控制方法与质量标准研究

研究建立重组人淋巴细胞功能相关抗原3-抗体融合蛋白(rhLFA3-IgG1)质量控制方法和质量标准。采用针对Jurkat细胞表面CD2分子的竞争结合试验测定融合蛋白的体外活性,以分子筛和离子交换色谱分别确定制品纯度,将制品还原、羧甲基化后再以胰蛋白酶裂解并经反相高效液相色谱进行肽图分析,采用ELISA法分别测定蛋白A与CHO宿主细胞蛋白残留量。建立了重组人淋巴细胞功能相关抗原3-抗体融合蛋白生物学活性、理化特性与残留杂质等质量控制方法和质量标准。所建立的质量控制方法和质量标准具有保证产品安全有效、质量可控的特点,可用于重组人淋巴细胞功能相关抗原3-抗体融合蛋白(rhLFA3-IgG1)的质量控制与产品检定。

重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(RCT-18)对大鼠的致畸作用

目的:观察重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(RCT-18)对大鼠胚胎及胎仔的发育毒性和致畸作用。方法:采用雌性SD大鼠,交配成功后随机分为4组,即RCT-18高(129 mg/kg)、中(37 mg/kg)、低(11 mg/kg)剂量组及阴性对照(0.9%NaCl注射液)组,每组≥25只,于妊娠第6～15天连续5次(隔天1次)经皮下注射给药。实验过程中观察动物的一般反应、体质量、摄食量变化,于妊娠第20天解剖孕鼠,对着床、吸收胎、死胎、活胎、黄体进行计数,对胎仔的体质量、身长、尾长,以及外观形态、内脏和骨骼发育等指标进行评价。结果:孕鼠、胚胎形成、胎仔生长发育、外观形态、内脏和骨骼发育等各项指标均无明显异常,与阴性对照组比较无明显毒性影响(P>0.05)。结论:在本试验条件下,RCT-18对SD大鼠未见明显母体毒性和胚胎-胎仔发育毒性,无致畸作用。

重组人肝星状细胞激活相关蛋白抗大鼠肝纤维化的作用

为了观察重组人肝星状细胞激活相关蛋白(rhSTAP)对四氯化碳(CCl4)致肝纤维化大鼠肝功能及病理形态学的影响。建立大鼠CCl4肝纤维化模型,从早期干预组自造模开始起注射给药,持续12周,治疗组自造模6周后开始给药,维持6周,造模周期结束后测定大鼠血清中谷丙氨转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、透明质酸(HA)的含量及肝组织中羟脯氨酸(Hyp)含量并对肝组织进行病理组织学检查。结果显示重组人源肝星状细胞激活相关蛋白能显著降低大鼠血清中ALT、AST、HA及肝组织中羟脯氨酸含量的升高,明显改善大鼠肝组织病理变化。因此重组人源肝星状细胞激活相关蛋白能有效干预CCl4诱导的大鼠肝纤维化,值得深入研究。

人工分子伴侣辅助鸡白细胞介素18重组蛋白的复性

目的:研究表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和β-环糊精(β-CD)组成的人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白的复性,以提高鸡IL-18重组蛋白复性率,获得更多具有良好活性的蛋白。方法:将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达产物主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声波破碎、洗涤后以6mol/L的盐酸胍溶解,使蛋白彻底变性,然后利用人工分子伴侣系统辅助蛋白复性。复性产物经透析纯化后,利用淋巴细胞增殖试验来检测其活性。结果:经SDS-PAGE分析表明,表达产物是与ChIL-18重组蛋白相符的Mr约44000的蛋白条带。利用人工分子伴侣系统辅助复性,鸡IL-18重组蛋白获得了42·54%复性率。鸡淋巴细胞增殖试验表明,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导增殖作用。结论:人工分子伴侣系统能够较好地辅助鸡IL-18重组蛋白复性,获得较高的复性率。其产物具有良好的生物学活性,为下一步鸡IL-18重组蛋白的应用研究奠定了试验基础。

重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白对鸡外周血T淋巴细胞亚群的影响研究

为了研究重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白（rChIFN-α-Linker-ChIL-2,重组融合蛋白）对SPF鸡外周血T淋巴细胞亚群含量影响,本研究采用流式细胞术对重组融合蛋白（第2组）和rChIFN-α蛋白（第3组）注射14日龄SPF鸡后不同时间对各试验组鸡外周血T淋巴细胞（PBLC）中CD3^＋CD4^＋、CD3^＋CD8^＋百分含量以及CD4^＋/CD8^＋比值进行检测。结果表明,与对照组相比,重组融合蛋白和rChIFN-α蛋白在鸡体内接种后3～14d均可明显提高鸡外周血T淋巴细胞中CD3^＋CD4^＋细胞百分含量,降低CD3^＋CD8^＋细胞的百分含量,提高CD4^＋/CD8^＋比值;接种后3～7d期间,第2组鸡的CD3^＋CD4^＋、CD3^＋CD8^＋细胞含量及CD4^＋/CD8^＋比值与PBS对照组（第1组）相比差异均极显著（P〈0.01）,第3组与第1组相比差异均显著（P〈0.05）。以上结果表明,重组融合蛋白和rChIFN-α蛋白接种鸡体后均可显著影响鸡PBLC中淋巴细胞亚群百分含量,提高CD4^＋/CD8^＋比值,增强机体的细胞免疫功能;重组融合蛋白对鸡淋巴细胞亚群百分含量、CD4^＋/CD8^＋比值影响程度和细胞免疫功能的增强作用优于rChIFN-α蛋白;重组融合蛋白在体内发挥了鸡α干扰素和白细胞介素-2对细胞免疫功能的协同增强作用。

重组病毒巨噬细胞炎性蛋白抗SIVmac251的体外研究

目的研究重组病毒巨噬细胞炎性蛋白vMIP体外抗猴艾滋病毒SIVmac作用效果和机制。方法分别在SIVmac接种前后将敏感细胞系与重组vMIP作用,检测细胞系病变(CPE)情况和病毒滴度水平,培养上清P27抗原水平。结果先用重组vMIP处理过的细胞,病毒感染后细胞病变程度很轻,培养上清P27抗原和病毒滴度水平明显低于对照组,先感染病毒再用重组vMIP处理组,病毒P27抗原水平和细胞内病毒滴度水平也显著降低,但降低程度不如先用重组vMIP处理后感染病毒组。结论重组vMIP有明显的抑制病毒进入靶细胞和保护靶细胞免受病毒感染的作用,进入靶细胞的抑制作用强于对已感染细胞的病毒抑制作用;说明主要作用机制为阻止病毒进入靶细胞,同时可能也通过某种机制抑制细胞内SIVmac病毒的产生。

共培养体系中重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞相关基因表达的影响(R68)

目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10(CPN10)对成骨细胞(OB)-外周血单个核细胞(PBMs)共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10(10μg/ml)处理组。主要观察指标:①采用TRAP染色及扫描电镜检测破骨细胞生成及小牛骨磨片吸收陷窝,②应用Realtime PCR检测与破骨细胞生成相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。结果两组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;但对照组所获TRAP阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及面积均显著小于CPN10组。Realtime PCR检测结果显示CPN10组与对照组相比NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG相对浓度分别为7.410±1.738、8.844±1.981、22.4272±2.058、2.445±0.2517(P<0.05),对照组各基因表达均显著低于CPN10组。结论 CPN10在成骨细胞-单个核细胞(OB-PBMs)共培养体系中可促进OC的生成及骨吸收,CPN10通过对成骨细胞的作用,致其分泌的OPG/RANKL比例失调,并上调破骨细胞相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。

重组红细胞生成刺激蛋白单次皮下给药耐受性、安全性及药代动力学研究

目的探讨健康人接受重组红细胞生成刺激蛋白(rESP)注射液(CHO细胞)单次皮下注射的耐受性、安全性与药代动力学特点。方法采用单中心、开放性剂量逐次增量法进行研究设计。rESP剂量在0.10~3.00μg/kg范围内共设7个剂量组,受试者均为健康人,各组按照既定剂量进行单次皮下注射,观察14 d,收集其中3个剂量组的药代动力学数据。结果共入组38例受试者,36例完成试验;有20例受试者报告22例次不良事件,其中18例次判定为与rESP给药相关,均为注射部位轻度疼痛;除1例因筛选期rESP抗体阳性退出外,其余受试者给药前后内源性促红细胞生成素(EPO)抗体和rESP抗体检测均为阴性,故3.00μg/kg确定为最大耐受剂量;在0.25~2.00μg/kg剂量范围内,rESP皮下吸收过程不受给药剂量影响,吸收和消除过程基本符合线性动力学特征,达峰时间约为60 h,平均滞留时间(MRT)为195.97 h,平均终末半衰期(t_(1/2z))为120.7 h。结论 rESP耐受性与安全性良好,且rESP在人体内的吸收和消除过程符合线性动力学特征,消除半衰期长。

miR-367-3p调控细胞周期素D2重组蛋白表达对肺癌细胞增殖、迁移的影响

目的探讨miR-367-3p调控细胞周期素D2重组蛋白(CCND2)表达对肺癌细胞增殖、迁移的影响。方法选取人肺癌细胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647、人正常肺细胞HLF-a,qRT-PCR法测定细胞中miR-367-3p表达水平;将Calu细胞分为对照组、miR-367-3p NC组、miR-367-3p mimic组、miR-367-3p mimic+pc-CCND2组;CCK-8法测定Calu细胞活力;流式细胞仪测定细胞凋亡能力;Transwell实验测定细胞侵袭能力;划痕实验测定Calu细胞迁移能力;WB法测定Calu细胞CCND2及凋亡、侵袭相关蛋白表达;荧光素酶实验测定miR-367-3p与CCND2的靶向关系。结果miR-367-3p在人肺癌细胞中呈现低表达;与对照组比较,miR-367-3p mimic组Calu细胞活力、侵袭、迁移能力、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低,凋亡能力、Caspase-3、Bax蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);CCND2过表达可逆转miR-367-3p过表达对Calu细胞活力、侵袭、迁移能力的抑制作用。荧光素酶实验结果显示,miR-367-3p与CCND2存在靶向调节关系。结论miR-367-3p可抑制人肺癌细胞Calu的增殖及迁移能力,可能是通过抑制CCND2实现的。

重组CCL2小鼠黑色素瘤B-16细胞的建立及生物学活性的鉴定

目的:在小鼠黑色素瘤B-16细胞中克隆表达趋化因子CCL2,以进一步研究趋化因子与肿瘤的关系。方法:从小鼠腹腔巨噬细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增CCL2 cDNA,将此片段重组于真核表达载体pcDNA3.0,脂质体FuGENE6转染鼠黑色素瘤B-16细胞,G-418筛选阳性克隆。结果:RT-PCR和免疫细胞化学鉴定转染B-16细胞中有较强CCL2的表达,体外趋化实验表明重组CCL2有生物学活性。结论:获得有趋化活性的重组CCL2的小鼠黑色素瘤B-16细胞。

牙龈卟啉单胞菌细胞分裂蛋白质FtsZ的GTPase活性的热稳定性

目的:探讨牙龈卟啉单胞菌(Pg)细胞分裂蛋白质FtsZ(PgFtsZ)的GTPase活性的热稳定性,阐明PgFtsZ的生物化学特性,为牙周病的治疗提供实验依据。方法:采用Malachite green assay法检测GTPase的活性,活性测定蛋白质为重组野生型PgFtsZ(WtPgFtsZ)和4种重组C末端缺失变异型PgFtsZ,即ZΔC01(C末端缺失73个氨基酸残基)、ZΔC02(C末端缺失128个氨基酸残基)、ZΔC03(C末端缺失177个氨基酸残基)和ZΔC04(C末端缺失233个氨基酸残基),各种PgFtsZ在未经处理时及煮沸加热处理5和10min后检测GTPase的酶活力值。结果:重组ZΔC04GTPase的活性在煮沸加热处理5和10min时均比未加热处理时的酶活性增加(P<0.05),重组WtPgFtsZ、ZΔC01、ZΔC02和ZΔC03在煮沸加热处理5min时GTPase的活性均较未煮沸加热处理时的活性增加(P<0.05),但进一步煮沸加热处理10min时,其GTPase的活性与未加热处理时相似。结论:Pg FtsZ是一种耐热蛋白质,并且C末端缺失233个氨基酸残基的缺失变异型ZΔC04表现出更强的耐热性能。

重组抗体-白细胞介素2融合蛋白对重症免疫缺陷鼠人神经纤维瘤肝转移灶生长的抑制作用

临床试验表明，在神经纤维瘤患者中单独应用rh IL-2或鼠抗GD2与人的嵌台变异体ch14.18能通过激活LAK细胞或通过外周血单核细胞介导的ADCC作用杀死瘤细胞，通过基因工程将二者融合成为ch14．18-IL-2融台蛋白能特异地将rh IL-2导向肿瘤位点，抑制瘤细胞播散与生长的能力要比单独使用rh IL-2更有效。本研究选用人神经纤维瘤系SKN—AS细胞5×10^5／100μl PBS注入CB—17scid小鼠脾包膜下构建肝转移模型。

小鼠IL-4重组质粒的构建及目的蛋白的表达和纯化

目的构建重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,纯化目的蛋白并鉴定。方法将优化后的小鼠IL-4cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,获得重组质粒pET32/rmIL-4,转入BL21(DE3)中经IPTG诱导表达得到包涵体。经复性处理后,依次用阴离子交换柱和分子筛纯化蛋白。对纯化得到的蛋白用Western blot检验免疫学特异性,用mIL-4生长依赖性细胞株CTLL-2增殖实验和动物实验测定其生物学活性。结果经酶切和测序证实重组质粒pET32/rmIL-4构建成功。诱导得到的包涵体用3mol/L盐酸胍溶液洗涤后溶于加有β-巯基乙醇的7mol/L盐酸胍溶液中变性,在pH9.5的条件下梯度透析复性。纯化出的蛋白经Western blot鉴定,能与抗小鼠IL-4抗体特异性结合;经细胞和动物实验鉴定,rmIL-4蛋白具有生物学活性,能刺激mIL-4生长依赖性细胞株CTLL-2增殖,使小鼠体内细胞因子发生从TH1到TH2的漂移。结论成功制备了高纯度、具有生物学活性的小鼠IL-4,为进一步研究其生物学功能提供了条件。