重组结核杆菌融合蛋白在肺结核密切接触者中筛查结核分枝杆菌感染效果分析

目的:探讨重组结核杆菌融合蛋白(recombinant mycobacterium tuberculosis fusion protein,EC)皮肤试验在筛查肺结核患者密切接触者结核分枝杆菌感染中的实用性和有效性,为进一步优化结核感染检测提供技术建议,了解密切接触者结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)现状。方法:2023年10月23日至11月14日在上海市奉贤区和金山区共选取140名肺结核密切接触者作为研究对象,对每名研究对象同时采用γ-干扰素释放试验(IGRA)和EC皮肤试验进行结核感染检测,采用Kappa值检验两种方法结果一致性,采用χ^(2)检验比较两组检测方法之间的差异,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:140名研究对象,包括男性55例,女性85例;IGRA阳性率为15.00%(21/140),EC皮肤试验阳性率为14.29%(20/140),两种试验方法一致性检验Kappa值为0.857,差异无统计学意义(χ^(2)=0.029,P=0.866),两种检测方法检测结果为高度一致性;以IGRA作为结核感染的参考标准,EC皮肤试验的敏感度为85.71%(18/21)、特异度为98.32%(117/119)、阳性预测值为90.00%(18/20)、阴性预测值为97.50%(117/120);男性EC阳性率(32.73%,18/55)明显高于女性(2.35%,2/85),差异有统计学意义(χ^(2)=17.983,P<0.001)。结论:EC皮肤试验具有较强的特异性,可用于肺结核密切接触者结核分枝杆菌感染筛查,但受限于使用年龄和接种禁忌证,可采用IGRA对无法进行EC皮肤试验者进行补充检测。

结核分支杆菌重组38KDa蛋白质抗原免疫学特性的研究

目的研究重组结核分支杆菌蛋白38KDa(rTPA38)的免疫学特性,以寻找特异性的诊断制剂。方法皮肤试验轮圈法:分别以HRV全菌体、卡介苗、堪萨斯、偶发、瘰疬分支杆菌致敏豚鼠备用;以5IU国际37标准品PPD为阳性对照,0.2μg重组rTPA38抗原分别于背部皮内注射48h观察红肿、硬结反应的纵横径。以rTPA为抗原,PPD为对照,用ELISA法检测血清中的特异性抗结核抗体。结果rTPA与PPD均可诱发豚3838鼠迟发型超敏反应(DTH),所产生的DTH反应与PPD相似,而对堪萨斯、偶发、瘰疬分支杆菌致敏的豚鼠不产生DTH反应。238例肺结核病组、rTPA和PPD检测的灵敏度分别为65.1%、72.7%。健康献血员组、非结核38呼吸疾病组和卡介苗接种阳转者血清同时用rTPA和PPD检测,rTPA的特异性分别为95.6%、95.9%、383888.5%;PPD的特异性分别为91.8%、85.4%、68.7%。统计结果表明rTPA蛋白和PPD检测非结核呼吸疾病组,其38阳性率差异有显著性(P<0.05)。两者检测卡介苗接种阳转组的阳性率和血清抗体滴度差异有显著性(P<0.05)。结论rTPA38诱发豚鼠的DTH反应与PPD相似。rTPA蛋白抗原有较高的特异性和灵敏度,是ELISA法的38可靠抗原,可替代PPD成为一种新的特异性诊断制剂。

重组结核分支杆菌16000蛋白抗原(rPA16)的免疫原性研究

目的 :研究结核分枝杆菌重组 16 0 0 0蛋白 (rPA16 )诱发家兔产生抗体的能力并评价其血清学诊断的价值。方法 :家兔按注射的抗原及佐剂的不同分组 ,皮下多点注射分别进行免疫。 6次免疫后采血 ,双向琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验 (ELISA)跟踪兔血清抗体效价的时间效应并检测兔血清与所试各类分支杆菌PPD有无交叉反应 ;同时检测rPA16与各分支杆菌PPD的免疫羊血清的反应 ,并用rPA16抗原检测人血清标本 ,分析该抗原的临床检测的敏感性和特异性。结果 :兔血清抗体效价结果显示 :5个月后 ,加佐剂的抗原组的兔免疫血清仍能检测到抗体 ,不加佐剂组 2个月后血清抗体检测即为阴性。ELISA检测兔免疫血清比双向琼脂扩散方法要更敏感 ,rPA16抗原加佐剂引起的兔血清抗体滴度最高可达 1∶6 4 0 0 ,不加佐剂组的血清抗体滴度仅为 1∶4 0 0。ELISA法分析抗rPA16的兔血清的特异性表明其特异性较好 ,仅与牛、人型结核分支杆菌的PPD呈阳性反应 ,与其他所试分支杆菌PPD反应均为阴性。同时又分析了rPA16抗原的特异性 ,与人型PPD相比 ,该抗原只与所试各类分支杆菌、BCG、牛分支杆菌免疫的血清呈阳性反应 ,而人型PPD则基本上与结核分支杆菌免疫的血清均呈阳性反应。ELISA检测血清标本结果 :肺结核病组中rPA16和PPD检测敏感性?

重组结核分支杆菌38000蛋白质抗原免疫学特性的研究

目的 :探讨国产结核分支杆菌蛋白 380 0 0 (rTPA38)的免疫学特性 ,用以寻找特异性的诊断试剂和筛选新一代疫苗。方法 :( 1)皮肤实验法。H37RV致敏豚鼠 ,5IU国际标准品PPD为阳性对照 ,0 .2 μg重组rTPA38抗原分别于背部皮内注射 ,2 4,48,72h后测量红肿硬结反应横纵径。 ( 2 )ELISA检测 9种羊抗分支杆菌血清并检测结核病人血清中特异性抗结核抗体。结果 :0 .2 μgrTPA38蛋白质抗原在 2 4,48,72h结果基本相似 ,与国家标准品相比均可诱发豚鼠迟发性超敏反应 (DTH) ,其效力与PPD相似。rTPA38只与羊抗牛、BCG、耻垢分支杆菌有交叉反应。用rT PA38和PPD为抗原 ,检测肺结核疾病组灵敏度分别为 6 7.2 % ,72 .5 % ;健康献血员组、非结核呼吸疾病组、卡介苗阳转组 ,rTPA38特异性分别为 96 8% ,96 .7% ,87 5 % ;PPD特异性分别为 93.7% ,85 .7% ,6 8.7%。统计结果表明 ,rT PA38蛋白与PPD检测非结核呼吸疾病组、卡介苗阳转组特异性均有显著意义 (P <0 .0 5 )。结论 :rTPA38具有较高的特异性和敏感性 ,并能诱发豚鼠DTH反应 ,有望成为一种新的特异性诊断试剂。

几种结核分支杆菌重组蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究

目的 了解结核分支杆菌重组抗原ESAT6 (E)、MPT6 4 (M )、Ag85A(A)及两两混合物诱发豚鼠产生迟发型超敏 (DTH)反应的能力。方法 常规皮肤实验法 :灭活H3 7Rv全菌体致敏豚鼠 ,皮肤试验以生理盐水为阴性对照 ,5UPPD标准品为阳性对照 ,0 .8μgE、0 .8μgM、0 .8μgA、0 .4 μgA + 0 .4 μgM、0 .4 μgA + 0 .4 μgE、0 .4 μgE + 0 .4 μgM分别于背部皮内注射 ,注射后 2 4、4 8、72h分别测量硬结反应横、纵直径 (mm ) ,取二者的平均值。皮肤试验轮圈法 :生理盐水、5UPPD及 0 .8μgE、0 .8μgM、0 .8μgA、0 .4 μgA + 0 .4 μgM、0 .4 μgA + 0 .4 μgE、0 .4 μgE + 0 .4 μgM ,以轮圈法注射于同一只豚鼠背部两侧 ,每批 6只 ,共 3批。注射后 2 4、4 8、72h分别测量硬结反应横、纵直径 (mm) ,取二者的平均值。结果 常规皮肤试验 0 .8μgM、A、M +E及E +A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,而 0 .8μgE抗原及M +A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比有显著性差异(P <0 .0 5 )。时间效应 :重组抗原及其混合物诱发豚鼠DTH的平均直径 2 4h平均直径显著高于 4 8h平均直径 (P <0 .0 5 ) ,2 4h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后 ,结果与常规皮肤试验结果一致。结论 从试验结果?

重组结核杆菌融合蛋白的临床综合评价

目的评价重组结核杆菌融合蛋白(EC)的有效性、安全性、经济性、创新性、适宜性和可及性,为遴选结核杆菌感染诊断和结核病辅助诊断的皮肤检测药品提供证据。方法采用系统评价法分析EC与结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)的有效性和安全性;以最小成本分析、成本-效果分析、成本-效用分析评价EC与TB-PPD的短期经济性,采用成本-效用分析评价两者的长期经济性;采用系统评价法、改良德尔菲专家咨询法确定创新性、适宜性和可及性评价的指标,通过各指标的权重计算EC和TB-PPD的各维度的综合评分。结果EC的有效性、安全性、经济性、创新性、适宜性评分均高于TB-PPD;两药的可负担性评分一致,EC的可获得性评分低于TB-PPD。考虑维度和指标权重后,EC的有效性、安全性、经济性、创新性、适宜性、可及性评分及其综合评分均高于TB-PPD。结论相较于TB-PPD,EC的有效性、安全性、经济性、创新性、适宜性和可及性均表现更优;但在可及性维度下,EC的可获得性应进一步改善。

重组结核杆菌融合蛋白皮肤试验在肾透析患者诊断结核潜伏感染的应用价值

目的 评估重组结核杆菌融合蛋白(ESAT6-CFP10,EC)皮肤试验在肾透析患者中诊断结核潜伏感染的价值。方法 纳入某医院67例肾透析患者,同时接受结核菌素试验(the tuberculin skin test, TST)和γ-干扰素释放实验(interferon gamma release assay, IGRA),并以TST和Quanti FERON-TBgold(QFT,种IGRA方法)作为参照标准,衡量EC皮肤试验的灵敏度和特异度。结果 67例肾透析患者中,EC皮肤试验、TST、QFT阳性率分别为11.3%(7/62)、25.8%(16/62)、22.4%(15/67),差异无统计学意义(χ^(2)=4.051,P=0.105)。分别以TST、QFT、TST&QFT为参照标准,EC皮肤试验灵敏度分别为31.3%(95%CI:11.0%~58.7%)、50.0%(95%CI:23.0%~77.0%)、83.3%(95%CI:35.9%~99.6%),特异度分别为95.7%(95%CI:85.2%~99.5%)、100.0%(95%CI:92.6%~100.0%)、96.4%(95%CI:87.7%~99.6%)。结论 EC皮肤试验在肾透析患者中的结核潜伏感染诊断价值低于QFT,推荐使用QFT。

重组结核分支杆菌38kD和16kD蛋白用于结核病血清学诊断的价值

目的 探讨国产重组结核分支杆菌蛋白 38kD(rTPA38)和 16kD(rTPA16)用于结核病的诊断价值。方法 以rTPA38和rTPA16为抗原 ,PPD为对照 ,用ELISA法检测血清中特异性抗结核抗体。结果 2 4 6例肺结核病组 ,rTPA38、rTPA16和PPD检测的灵敏度分别为 66.3%、63.0 %和 72 .3%。健康献血组、非结核呼吸疾病组和卡介苗接种阳转组血清同时用rTPA38、rTPA16和PPD检测 ,rTPA38特异性分别为 97.6%、96.8%、86.0 %。rTPA16特异性分别为 94 .7%、93.1%、75 .0 %。PPD特异性为93.4 %、85 .7%、67.9%。统计分析显示 ,rTPA38蛋白和PPD检测非结核呼吸疾病组 ,其阳性率有显著性差异 (P <0 .0 5 )。两者检测卡介苗接种阳转组阳性率和血清抗体滴度有显著性差异 (P <0 .0 5 )。rTPA38和rTPA16同时检测 10 8例肺结核病组血清可提高 11.1%的阳性率。结论 rTPA38蛋白抗原有较好的灵敏度和较高特异性 ,是ELISA的可靠抗原 ,与rTPA16联用可提高灵敏度 ,对结核病血清学诊断有较高参考价值。

重组结核杆菌融合蛋白对HIV感染人群结核潜伏感染效果评价

目的评价重组结核融合蛋白(EC)对艾滋病(HIV)感染人群结核潜伏感染(LTBI)的诊断价值。方法将EC注射在受试者的右前臂1/3处,结核菌素(PPD)注射于受试者左前臂1/3处,观察注射部位72小时后红晕和硬结直径的大小,判断是否为结核潜伏感染。结果对122例HIV/AIDs进行了2种方法的结核潜伏性感染(LTBI)筛查,PPD阳性人数31名,阳性率25.41%;EC阳性人数22名,阳性率18.03%;2两种筛查方法阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。2种筛查方法均为阳性21人,均为阴性90人,不一致11人,一致率90.98%,Kappa值0.737。结论重组结核杆菌融合蛋白对HIV人群筛查结核潜伏感染有一定的价值,该产品不受卡介苗疫苗接种的影响,且该产品特异度实优于TST,值得推广。

副结核分支杆菌Hed蛋白的抗原性分析及在间接ELISA中的应用

从副结核分支杆菌K-10菌株克隆出840 bp的hed基因片段,插入原核表达载体pET-32a(+),转化至Escherichia coliBL21(DE3),在0.8 mmol.L-1 IPTG诱导下进行表达,纯化重组蛋白,将其进行Western-blot分析、小鼠免疫试验,包被ELISA板,建立间接ELISA方法。结果显示:重组蛋白具有良好的抗原性,方阵滴定法确定了间接ELISA方法的抗血清最佳稀释度(100倍)和抗原包被浓度(4.4μg.mL-1),该方法具有较好的特异性和敏感性。

结核分枝杆菌重组Mtb81蛋白抗原血清学诊断价值的研究

目的研究重组Mtb81(rMtb81)蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,寻找更有效的结核病诊断试剂。方法应用基因工程技术表达、纯化rMtb81蛋白,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测192名健康者和210例肺结核患者血清中抗结核抗体。结果 rMtb81蛋白在大肠埃希菌细胞内以包涵体形式高效表达,表达量占菌体总蛋白的30%左右,相对分子量约80.7kD,具有良好的抗原特异性。在210例结核病患者血清中,103例菌阳患者和107例菌阴患者抗rMtb81抗体的阳性率分别为37.9%和41.1%,总的灵敏度为39.5%。在192例正常人血清中,95例PPD阴性者和97例PPD阳性者抗Mtb81抗体的阳性率分别为1.1%和6.2%。结论 rMtb81蛋白可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。

结核分枝杆菌抗原Rv2654重组蛋白的表达和纯化及其诱导的免疫应答特征

目的:随着卡介苗的保护效应日趋减弱,以及结核分枝杆菌耐药株的广泛存在,全球尚缺乏控制结核病的有效疫苗,全球结核病发病率和病死率仍然较高。本研究旨在分析结核分枝杆菌抗原Rv2654重组蛋白在诱导小鼠细胞免疫和体液免疫应答中的作用,评价其作为抗结核病候选疫苗的潜力。方法:在细菌的对数生长期加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)诱导细菌表达Rv2654重组蛋白,用亲和层析纯化,蛋白质印迹法鉴定Rv2654重组蛋白。采用ELISA方法检测不同人群血清与Rv2654重组蛋白的免疫反应性。以Rv2654重组蛋白免疫昆明小鼠,采用细胞因子磁珠阵列法检测小鼠外周血Th1/Th2类细胞因子水平,并以流式细胞术分析小鼠脾T、B淋巴细胞亚群分布。结果:成功表达Rv2654重组蛋白,以Rv2654重组蛋白作为抗原的ELISA结果显示其与卡介苗接种者或活动期结核患者血清均有反应性。Rv2654重组蛋白免疫小鼠可促进小鼠外周血IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10等多种细胞因子表达(均P<0.05),流式细胞术结果显示Rv2654重组蛋白可显著刺激CD4+T细胞和CD8+T细胞分化为效应T细胞,这种作用在联合卡介苗应用时更为明显,Rv2654重组蛋白也能刺激小鼠B细胞活化增殖并向记忆细胞分化。结论:Rv2654重组蛋白可诱导小鼠的细胞免疫应答,而且与卡介苗接种者和活动性肺结核患者血清有较好的结合能力,有望作为结核病免疫学预防和诊断类疫苗的候选抗原。

重组结核分枝杆菌融合蛋白皮肤试验与TST在学校结核潜伏感染筛查中的比较

目的 比较重组结核分枝杆菌融合蛋白皮肤试验(EC)与结核菌素皮肤试验(TST)两种检测方法的筛查效能及成本效益,探讨更适合学校结核潜伏感染的筛查方法。方法 选取2021年9月重庆市某中学高一新生共计283名,采用整群随机抽样方法分为EC组(138名)和TST组(145名),分别于左前臂皮内注射0.1 mL EC或0.1 mL TST,观察注射72 h后皮肤反应。皮肤试验前采集283名学生的静脉血,进行体外γ-干扰素释放试验(IGRA)检测,以IGRA检测结果为标准,分别计算EC、TST试验结果的灵敏度、特异度、漏诊率、一致率,并分析三者的成本效益。结果 EC的灵敏度、特异度、漏诊率、一致率分别为54.55%、93.70%、45.45%、90.58%;TST的灵敏度、特异度、漏诊率、一致率分别为61.11%、81.10%、38.89%、78.62%。每检出1例结核分枝杆菌感染者,TST、EC、IGRA的检测成本分别为124.29、492.86、4 879.31元。结论 EC与IGRA检测结果一致性较好,较TST的特异度和一致率更高,检测成本效益较高,简便易行,有望成为学校结核分枝杆菌潜伏感染新的筛查方法。

结核分枝杆菌重组Ag85A蛋白抗原诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究

目的 :结核分枝杆菌重组Ag85A抗原诱发豚鼠迟发型超敏 (DTH)反应。Ag85A剂量、观察时间对DTH的影响。方法 :常规皮肤实验法 :灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠 ,皮肤试验以生理盐水为阴性对照 ,5IUPPD标准品为阳性对照 ,0 .1、0 .2、0 .4、0 .6、0 .8及 1.0 μg重组抗原分别于背部皮内注射 ,注射后 2 4、4 8及 72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。皮肤试验轮圈法 :生理盐水、5IUPPD及 0 .4、0 .6、0 .8、1.0 μgAg85A抗原 ,以轮圈法注射于同一只豚鼠背部一侧 ,每批 6只 ,共 3批。于注射后 2 4、4 8、72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。结果 :常规皮肤试验 0 .1、0 .2 μg重组Ag85A抗原诱发DTH的平均直径与PPD相比有显著差异 (P <0 .0 5 ) ,而 0 .4、0 .6、0 .8、1.0重组Ag85A抗原诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比 ,无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,2 4h平均直径显著高于 4 8h平均直径 (P <0 .0 5 ) ,2 4h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后结果与常规皮肤试验结果一致。结论

结核分枝杆菌重组蛋白抗原Rv2041c、Rv1419、Rv2991和Rv3428c在结核病血清学诊断中的价值

目的分析结核分枝杆菌重组蛋白抗原Rv2041c、Rv1419、Rv2991和Rv3428c用于辅助结核病血清学诊断的价值。方法选择我院2016年12月至2018年12月河南省胸科医院结核科与呼吸科接诊的234例活动性肺结核患者作为结核组;选择同期我院接诊的非结核病其他肺部疾病者128例作为其他肺部疾病组;选择同期河南省中医学院一附院接受常规体检的110例健康人群作为健康组。检测各组纳入者结核分枝杆菌重组蛋白抗原Rv2041c、Rv1419、Rv2991及Rv3428c水平表达,比较痰菌培养阴阳性结核病患者各结核分枝杆菌重组蛋白抗原水平表达。对各抗原水平表达检测用于结核病血清学诊断的价值行受试者工作曲线(ROC)分析检验。结果结核组患者各血清结核分枝杆菌蛋白抗原水平表达最高,后由高至低依次为其他肺部疾病组、健康组,结核组与其他两组比较差异有统计学意义(P<0.05),其他肺部疾病组与健康组比较,差异无统计学意义(P>0.05);全部234例结核组患者中,检出痰菌阳性者168例,占比为71.79%;痰菌阴性组与痰菌阳性组各结核分枝杆菌重组蛋白抗原水平表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)。经受试者工作曲线检验结果显示,结核分枝杆菌重组蛋白抗原Rv2041c、Rv1419、Rv2991、Rv3428c用于结核病血清学诊断曲线下面积分别为:0.821、0.802、0.824、0.852,各抗原用于结核病血清学诊断的特异度分别为86.97%、84.87%、86.97%、87.82%。结论结核分枝杆菌重组蛋白抗原Rv2041c、Rv1419、Rv2991、Rv3428c辅助结核病的血清学诊断均有着较高的特异度,临床实际中,可将各抗原联合检测以提高抗结核抗体检测敏感度,提高结核病的检出率。

生物信息学技术在结核分支杆菌ESAT-6重组抗原研究中的应用

目的应用生物信息学分析软件预测分析结核分支杆菌ESAT-6基因及相关蛋白的特性。方法应用NCBI、Expasy等在线生物信息学网站及DNAstar、Rasmol等软件包分析ESAT-6并进行同源比对;预测二级、三级结构,以及预测主要抗原表位等。结果结核分支杆菌重组抗原ESAT-6与已发表氨基酸序列同源性为90%。预测该蛋白分子质量约为9885.7Da,PI为4.6,4个抗原表位,其结构域位于56-87位。结论生物信息学技术在结核分支杆菌ESAT-6重组抗原研究中有一定的理论和应用价值。

结核分支杆菌14KDa蛋白的基因克隆、表达、纯化及其抗原性的研究

目的基因克隆、表达、纯化结核分枝杆菌14KDa蛋白,研究其抗原性,评价其在血清学诊断中的价值。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增14KDa蛋白基因片断,将其插入到高效表达载体PET-22b(+)上,构建重组质粒PET-22b(+)/14KDa,重组质粒在大肠杆菌中由IPTG诱导表达,表达产物经金属离子鳌合亲和层析方法纯化,免疫印迹和酶联免疫吸附(ELISA)试验分析重组蛋白的抗原性。结果构建了具有正确基因序列的14KDa蛋白重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中以可溶性蛋白形式表达,重组蛋白的表达量占菌体蛋白的40.8%,经过一步金属离子鳌合亲和层析后得到纯度为94.3%的目的蛋白。免疫印迹试验结果表明该蛋白能与羊抗结核血清发生特异免疫结合反应。应用ELISA方法对结核血清参考品进行检测,敏感性和特异性分别为75.6%和96.0%。结论获得了能高效表达14KDa蛋白的大肠杆菌工程菌,目的蛋白以可溶性形式表达,该重组蛋白具有良好的免疫原性,可望成为结核血清学的诊断抗原之一。