共培养体系中重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞相关基因表达的影响

目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10(CPN10)对成骨细胞(OB)-外周血单个核细胞(PBMs)共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10(10μg/ml)处理组。主要观察指标:1采用TRAP染色及扫描电镜检测破骨细胞生成及小牛骨磨片吸收陷窝,2应用Realtime PCR检测与破骨细胞生成相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。结果两组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;但对照组所获TRAP阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及面积均显著小于CPN10组。Realtime PCR检测结果显示CPN10组与对照组相比NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG相对浓度分别为33.4798±2.0929、47.974±5.1628、47.0861±2.2033、7.4642±0.6791(P<0.05),对照组各基因表达均显著低于CPN10组。结论 CPN10在成骨细胞-单个核细胞(OB-PBMs)共培养体系中可促进OC的生成及骨吸收,CPN10通过对成骨细胞的作用,致其分泌的OPG/RANKL比例失调,并上调破骨细胞相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。

共培养体系中重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞相关基因表达的影响(R68)

目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10(CPN10)对成骨细胞(OB)-外周血单个核细胞(PBMs)共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10(10μg/ml)处理组。主要观察指标:①采用TRAP染色及扫描电镜检测破骨细胞生成及小牛骨磨片吸收陷窝,②应用Realtime PCR检测与破骨细胞生成相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。结果两组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;但对照组所获TRAP阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及面积均显著小于CPN10组。Realtime PCR检测结果显示CPN10组与对照组相比NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG相对浓度分别为7.410±1.738、8.844±1.981、22.4272±2.058、2.445±0.2517(P<0.05),对照组各基因表达均显著低于CPN10组。结论 CPN10在成骨细胞-单个核细胞(OB-PBMs)共培养体系中可促进OC的生成及骨吸收,CPN10通过对成骨细胞的作用,致其分泌的OPG/RANKL比例失调,并上调破骨细胞相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。

人破骨细胞分化中重组结核杆菌热休克蛋白10的影响

背景:体外小鼠颅盖骨实验已证实了其结核杆菌热休克蛋白10的破骨效应。目的:在诱导破骨细胞分化的体外细胞培养系统中,研究重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞分化的影响及相关机制。方法:选用人巨噬细胞集落刺激因子依赖性附着性血液单个核细胞,实验分为:核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组、核因子κB受体活化因子配体组、重组结核杆菌热休克蛋白10组(1 mg/L)、阴性对照组(完全培养基),核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组、重组结核杆菌热休克蛋白10组中重组结核杆菌热休克蛋白10质量浓度为1 mg/L,在含有巨噬细胞集落刺激因子的a-MEM培养液重悬单核细胞,各组培养7,14,21 d后,观察所形成的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性染色多核细胞的形态、数目、骨吸收面积;各组NFATc1、c-Fos基因及蛋白表达情况。结果与结论:阴性对照组无抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞分化生成,其余各组均有抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞分化生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;重组结核杆菌热休克蛋白10组形成的破骨细胞分化细胞数目、吸收陷窝数目及陷窝面积显著低于核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组;阴性对照组NFATc1、c-Fos基因表达水平显著低于核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组和重组结核杆菌热休克蛋白10组,而重组结核杆菌热休克蛋白10组表达NFATc1、c-Fos蛋白,显著低于核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组。提示结核杆菌热休克蛋白10参与破骨细胞分化的形成,可能与诱导相关基因NFATc1、c-Fos表达上调有关。

人结核杆菌热休克蛋白65重组卡介苗疫苗的构建、表达及鉴定

目的 构建人结核杆菌热休克蛋白 6 5 (HSP6 5 )重组卡介苗 (BCG)疫苗。方法 用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原 85B (Ag85B)的信号肽DNA序列 ,从 pCMV MTHSP 6 5质粒中扩增出HSP6 5全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒 pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下游 ,构建一个分泌型的原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5。利用电穿孔的方法将该质粒转入BCG中 ,经热诱导后 ,用SDS PAG电泳来观察其表达水平。利用Westernblot来检验HSP6 5的生物学活性。结果 酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明 ,所克隆的信号肽DNA片段和热休克蛋白 6 5DNA片段与报道结果完全一致 ,重组体的连接方向正确 ,阅读框与预期完全一致。热诱导后 ,重组BCG表达的 6 5kD (1kD =0 992 1ku)蛋白占菌体总蛋白的 35 6 7% ,占裂解物上清总蛋白的 74 0 9% ,表明重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Westernblot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP6 5的抗体特异性结合。结论 成功构建分泌型原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5 ,重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的HSP6 5具有生物学活性 ,重组BCG疫苗构建成功。

结核杆菌热休克蛋白-65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达

目的 构建结核杆菌热休克蛋白 -65 (HSP65 )真核表达质粒 ,并探讨其在人肺癌细胞系A549中的表达 .方法 用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出HSP65基因 ,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( +) ,构建成重组质粒pcDNA3.1-HSP65 ;然后用电穿孔的方法将质粒pcDNA3.1-HSP65转染到A549细胞 ,经G418筛选后获得抗性细胞克隆 ;用RT -PCR的方法检抗性细胞中HSP65mRNA的表达 .结果 经酶切鉴定和DNA序列测定证实重组质粒pcDNA3.1-HSP65构建正确 ;RT -PCR检测结果发现 ,重组质粒pcDNA3.1-HSP65转染的A549细胞总RNA中结核杆菌HSP65mRNA为阳性 .结论 真核表达质粒pcDNA3.1-HSP65构建成功 。

结核杆菌热休克蛋白70在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

为获得结核杆菌热休克蛋白 70在毕赤酵母中的分泌表达。构建了酵母表达质粒pPIC9K hsp70 ,并将其线性化后用电穿孔法导入PichiapastorisGS115 ,经PCR方法筛选出阳性菌落 ,在 0 .5 %甲醇诱导下分泌表达。所得产物经离心收集上清、超滤浓缩脱盐、亲和层析后 ,分别用SDS PAGE、Westernblot和动物免疫实验对上清中的重组Hsp70进行鉴定 ,并考察产物对DC的作用。经SDS PAGE、Westernblot分析表明表达的Hsp70表观分子量为 70kD并能特异性地与抗 Mt.Hsp70单抗结合 ,动物实验表明重组的Hsp70能在体诱导免疫应答。重组Hsp70能够诱导DC成熟并释放Th1型细胞因子。摇瓶发酵表达量达 12 0mg L ,占培养上清 30 %以上。

结核杆菌热休克蛋白70基因的克隆与原核表达

目的 :克隆结核杆菌热休克蛋白 70 (TBhsp70 )基因 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因 ,并将其克隆到pUC19中 ,进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX 4T 1中 ,构建重组表达质粒pGEX TBhsp70 ,在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果 :成功地克隆了TBhsp70基因。DNA测序证实 ,与GenBank公布的序列一致。含pGEX TBhsp70基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,能够表达相对分子质量 (Mr)约为 96 0 0 0的融合蛋白。结论 :获得了TBhsp70基因 ,成功地构建了原核表达质粒pGEX TBhsp70 ,并在大肠杆菌得到表达 ,为其相关研究奠定了一定的基础。

结核杆菌热休克蛋白70与绿色荧光蛋白基因真核共表达质粒的构建

目的利用pIRES-EGFP载体构建含有人巨细胞病毒(cytomegaloviru,CMV)启动子调控表达的结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子真核表达载体pCMV-hsp70-IRES-EGFP。方法根据mtHSP70基因全长cDNA的特异引物PCR扩增获得mtHSP70基因序列。将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒PMD-18T-mtHSP70,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切pMD18T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒。将mtHSP70基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含mtHSP70和EGFP基因的重组质粒。Lipofectamine介导下转染B16细胞,并分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达和以Westernblot检测mtHSP70蛋白表达情况。结果酶切见特异酶切图谱,该载体在瞬时表达时获得mtHSP70/EGFP的良好表达。结论含mtHSP70和EGFP基因双顺反子真核表达载体pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP构建成功,为研究基于以GFP为报告基因的mtHSP70的肿瘤DNA疫苗对肿瘤的治疗作用及机制奠定了实验基础。

人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定

用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70（hsp70）基因的启动子序列和卡介苗（BCG）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（E.coli）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆菌hsp70编码基因起始密码（ATG）上游150个脱氧核苷酸，其中在ATG上游—12～—8核苷酸处有核糖体结合位点（SD序列）GGAGG，在RNA聚合酶的结合位点（RNApolymerase－bindingsite，RBS）区含有与E．coli相同的三核苷酸高度保守序列TTG。这些序列与E．coli5＇端调控区同源。在hsp70基因调控序列-10区两侧有反向重复序列TGCAGT，构成5＇端的茎环结构。其它分枝杆菌hsp基因启动子调控区均有类似的结构。对BCGα基因启动子和信号肽序列的测定，发现其启动子序列与hsp基因的SD、-10和-35序列有一定的区别，其序列分别为AAAGG、TATGTT、TCGACA。在ATG后的120个核苷酸序列所编码肽链具有信号肽的特征，在碱性氨基酸后紧跟一段疏水区，含有能被信号肽酶识别的Ala－X－Ala结构。

人乳头瘤病毒6型E7与结核杆菌热休克蛋白70融合基因的构建及原核表达

目的:构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段,测序后插入HSP70基因的5'端,构建HPV6E7与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-E7-HSP70;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,进行诱导表达和分离纯化。结果:成功地构建了pGEX-E7-HSP70原核表达质粒;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,经异丙醇-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达相对分子质量约为108000的蛋白;经谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达系统纯化,得到E7与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白。结论:成功获得HPV6型E7与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究该融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用奠定了基础。

结核杆菌截短型热休克蛋白原核表达的实验研究

探讨结核杆菌的截短型热休克蛋白原核表达技术.以结核杆菌BCG疫苗株为模板,设计PCR引物扩增hsp65基因片段,再以pET32a(+)为载体构建pET-hsp65表达质粒.将pET-hsp65表达质粒转化大肠杆菌BL21,经0.5mM IPTG诱导后,截短型HSP65蛋白与pET32a(+)载体自身的硫氧还蛋白融合表达,融合表达蛋白的分子量约为49.8kDa.

结核杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的高效自发再折叠和再组装

来自结核杆菌的小分子热休克蛋白Hsp16 3以九聚体的形式存在 .用三种不同的强变性条件 (10 0℃加热15min ,12mol/L脲或 8mol/L盐酸胍处理 4h)将Hsp16 3变性 ,然后通过冷却或透析使之复性 ,并利用孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳和圆二色性光谱比较了变性 复性前后Hsp16 3的各个层次高级结构 .结果显示 ,变性的Hsp16 3几乎可以完全恢复至天然构象 ,这表明小分子热休克蛋白Hsp16 3具有很强的自发折叠和组装能力 .

从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位

目的 建立一种有效的从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位HspA的方法。方法 重组基因工程大肠杆菌发酵后 ,表达的Hp的HspA包涵体经洗涤、变性、复性 ,采用QSepharoseHighPerformance阴离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析分离纯化。使用SDS PAGE和HPLC检测纯度 ,选用ELISA和动物实验对纯化蛋白的免疫学活性和生物学活性进行鉴定。结果 Hp的HspA包涵体经洗涤和溶解后 ,Hp的HspA的纯度 >60 %。包涵体溶解液经阴离子交换层析和凝胶过滤层析后纯度超过 95 %。Hp的HspA纯品经检测具有良好的免疫学活性和生物学活性。结论 本研究建立的分离纯化方法可从包涵体中获得高纯度的重组HspA蛋白 。

重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化

目的 在大肠杆菌中高效表达幽门螺杆菌的热休克蛋白A基因 (hspA) ,并对其初步纯化。 方法 用巢式PCR扩增hspA基因。经测序证实后 ,克隆于表达载体 pIM 1中 ,转化大肠杆菌。以SDS PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达 ,并测定N 端氨基酸的序列。采用固相镍离子亲和层析 ,对重组hspA进行初步纯化。结果 扩增的hspA基因为 35 7bp ,并在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。重组蛋白的表达量最高可达细菌总蛋白的 6 0 .5 %。免疫印迹及氨基酸测序结果证实 ,表达产物为幽门螺杆菌hspA亚单位。固相镍离子亲和层析初步纯化的重组HspA的纯度为 87.8%。结论 hspA亚单位的高效表达与初步纯化 。

携带幽门螺杆菌热休克蛋白B亚单位基因重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建和鉴定

背景:幽门螺杆菌(H.pylori)是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的重要致病菌,以减毒鼠伤寒沙门菌为载体构建活疫苗已成为探索新型H.pylori疫苗的重要途径。目的:构建携带H.pylori热休克蛋白B亚单位(hspB)基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌。方法:应用基因工程技术将1640 bp的hspB基因克隆入原核表达质粒pTrc99A。对重组质粒进行序列测定,并将测序结果与基因文库中H.pylori-hspB的基因和蛋白序列进行BLAST分析,再将重组质粒导入活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261。结果:重组质粒经聚合酶链反应(PCR)和双酶切,证实构建了携带hspB基因的重组原核表达质粒pTrc99A.hspB,后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261。所构建的重组质粒pTrc99A-hspB中所含的H.pylori-spB与基因文库中H.pylori-hspB基因和蛋白的同源性均为97％。结论:成功构建并鉴定了携带H.pylori-hspB基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌,为研制H.pylori口服疫苗奠定了基础。

分枝杆菌热休克蛋白65重组质粒的构建与原核表达

目的研究分枝杆菌热休克蛋白65(HSP65)重组质粒的构建与原核表达。方法 HSP65的开放阅读框经聚合酶链反应(PCR)扩增后,经NcoⅠ与NotⅠ内切酶依次酶切,连接至酶切后的原核表达载体PET-28a中,然后将重组质粒转入大肠杆菌BL-21中,PCR筛选阳性克隆,并经DNA测序进一步验证。阳性克隆进一步扩大培养,并进行乳糖诱导,十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳对菌体蛋白进行检测。结果成功扩增出1 623 bp的目的片段HSP65;测序结果显示,该片段与目的序列完全相符,重组子PET-28a/HSP65构建成功;乳糖诱导后的HSP65在大肠杆菌中实现高表达。结论分枝杆菌HSP65蛋白的成功表达,为研究其在抗肿瘤疫苗中的应用奠定了基础。

香砂六君子汤对脾胃虚弱型萎缩性胃炎大鼠胃窦黏膜组织白细胞介素-6、10及热休克蛋白70表达的影响

目的观察香砂六君子汤对脾胃虚弱型慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠胃窦黏膜组织白细胞介素(IL)-6、IL-10及热休克蛋白70(HSP70)基因及蛋白表达的影响,探讨其作用机制。方法受试大鼠按随机数字表法分为空白组和造模组,采用综合法复制脾胃虚弱型CAG动物模型,将成模大鼠随机分为模型组、阳性对照组和香砂六君子汤高、中、低剂量组。空白组和模型组大鼠予10 m L/(kg·d)蒸馏水灌胃,香砂六君子汤高、中、低剂量组分别予24、12、6 g/(kg·d)香砂六君子汤药剂灌胃,阳性对照组予0.30 g/(kg·d)维霉素药剂灌胃,连续120 d。检测各组大鼠胃窦黏膜组织IL-6、IL-10含量,实时荧光定量PCR检测胃窦黏膜组织IL-6、IL-10和HSP70 m RNA表达,蛋白免疫印迹法检测HSP70蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠一般生存状况较差,大鼠胃窦黏膜组织IL-6 m RNA表达、IL-6含量显著升高(P<0.05,P<0.01),IL-10 m RNA表达、IL-10含量显著降低(P<0.05,P<0.01),HSP70基因和蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,香砂六君子汤高剂量组大鼠一般生存状况明显改善,大鼠胃窦黏膜组织IL-6 m RNA表达、IL-6含量显著降低(P<0.05,P<0.01),IL-10 m RNA表达、IL-10含量显著升高(P<0.05),香砂六君子汤高、中剂量组HSP70基因和蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论香砂六君子汤对脾胃虚弱型CAG大鼠胃窦黏模具有保护作用。

重组人热休克蛋白70-抗原肽复合物对肿瘤的免疫治疗作用研究

目的:使用以毕赤酵母X-33为宿主菌,重组表达制备的rhHSP70与合成的HER2/neu抗原肽体外结合形成复合物,探讨其在肿瘤免疫治疗中的有效性。方法:在ADP存在的条件下,将rhHSP70与纯化的HER2/neu抗原肽体外非共价结合形成复合物,并分次免疫BALB/c小鼠,通过ELISPOT和颗粒酶释放法,检测该复合物诱导特异性CTL的能力。通过检测小鼠体内肿瘤的生长情况和肿瘤的组织切片,来观测该复合物对小鼠乳腺癌的免疫治疗作用。结果:rhHSP70-HER2/neu抗原肽复合物免疫小鼠后,可以增加T细胞分泌IFN-γ的能力,诱导出肿瘤特异性CTL,并对小鼠的乳腺癌有明显的治疗作用。结论:在毕赤酵母中重组表达的rhHSP70可以在体外与一定的抗原肽非共价结合形成复合物,该复合物具有较强的诱导特异性CTL的能力,可对实验鼠的乳腺癌起到明显的治疗作用。

热休克蛋白10和热休克蛋白的60表达、纯化及与线粒体DNA转录因子A相互结合

目的:表达、纯化热休克蛋白10(Hsp10)和热休克蛋白60(Hsp60),研究人类线粒体DNA转录因子A(TFAM)在体外与Hsp10,Hsp60间的相互交联作用。方法:使用Escherichia.Coli(E.coli)诱导表达含有6个组氨酸标记的Hsp10和Hsp60,镍离子鳌合树脂分离纯化后,体外分别与纯化TFAM共育,抗-TFAM抗体免疫沉淀,SDS-PAGE分离蛋白,CBB探测分析。结果:Hsp10可在体外与TFAM发生免疫共沉淀,Hsp60不能。结论:Hsp10可能为TFAM-复合体组分。