重组结核杆菌融合蛋白皮肤试验筛查HIV/AIDS病例结核分枝杆菌潜伏感染的效果分析

目的 评价重组结核杆菌融合蛋白皮肤试验(EC-ST)筛查艾滋病病毒感染者和艾滋病患者(HIV/AIDS)结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)的效果,为EC-ST筛查HIV/AIDS病例LTBI的适用性提供依据。方法 于2023年4—6月,选择江苏省扬州市在管在治的HIV/AIDS病例为研究对象,通过问卷调查收集基本资料,分别采用EC-ST和γ-干扰素释放试验(IGRA)筛查LTBI。以IGRA结果为诊断标准,分析EC-ST筛查阳性率、灵敏度、特异度和一致率,以及CD4^(+)T淋巴细胞(CD4)计数对EC-ST筛查效果的影响。结果 纳入HIV/AIDS病例523例,其中男性458例,占87.57%;女性65例,占12.43%;年龄M (QR)为48.00 (21.00)岁。EC-ST阳性率为7.27%,IGRA阳性率为7.46%,差异无统计学意义(P>0.05)。两种方法的一致率为94.84%,Kappa值为0.621 (95%CI:0.489~0.752,P<0.05);EC-ST的灵敏度为64.10%,特异度为97.31%。CD4计数<500和≥500个/μL组比较,两种方法的一致率分别为95.32%和94.44%,Kappa值分别为0.568和0.650 (均P<0.05),EC-ST阳性率、灵敏度和特异度差异无统计学意义(均P>0.05);CD4计数<200和≥200个/μL组比较,两种方法的一致率分别为96.55%和94.62%,Kappa值分别为0.648和0.619(均P<0.05),EC-ST阳性率、灵敏度和特异度差异无统计学意义(均P>0.05)。结论 EC-ST筛查HIV/AIDS病例LTBI的效果与IGRA存在一致性,且不受CD4计数水平的影响。

2023年江苏省扬州市17093名入学新生重组结核杆菌融合蛋白皮肤试验结果与肺结核检出情况分析

目的了解江苏省扬州市入学新生基于重组结核杆菌融合蛋白(EC)皮肤试验筛查出的结核分枝杆菌(MTB)感染和肺结核发病情况及影响因素,为完善扬州市学校结核病防控策略提供数据支撑和科学依据。方法对扬州市2023年秋季寄宿制初中、高中/职高及高校新生开展EC皮肤试验筛查,对EC皮肤试验阳性者再行胸部电子计算机断层扫描检查。分析比较新生中EC皮肤试验阳性与肺结核患者检出情况。结果EC皮肤试验筛查17093名新生,阳性173例(1.01%),发现肺结核患者18例(10.53/万)。多因素logistics回归分析显示中部地区[比值比(OR)=2.31,95%置信区间(CI):1.22~4.37]和西部地区(OR=5.99,95%CI:3.07~11.68)新生感染MTB风险高于东部地区;西部地区新生(OR=18.31,95%CI:2.43~138.05)检出肺结核的风险高于东部地区;结核病既往史(OR=7.47,95%CI:1.43~39.00)和结核病接触史(OR=6.79,95%CI:2.13~21.72)是新生感染MTB的危险因素;有结核病既往史(OR=31.77,95%CI:3.50~288.60)和有结核病接触史(OR=13.62,95%CI:1.63~113.66)的新生检出肺结核的风险也越高。结论应用EC皮肤试验开展结核病筛查是发现扬州市入学新生中结核病传染源的重要途径,针对MTB感染者和肺结核患者采取相应的防治措施,能够有效降低学校结核病疫情的发生风险,应推广至全市范围。来自中、西部地区、有结核病既往史及结核病接触史的新生是结核病筛查的重点人群。

重组结核杆菌融合蛋白在肺结核密切接触者中筛查结核分枝杆菌感染效果分析

目的:探讨重组结核杆菌融合蛋白(recombinant mycobacterium tuberculosis fusion protein,EC)皮肤试验在筛查肺结核患者密切接触者结核分枝杆菌感染中的实用性和有效性,为进一步优化结核感染检测提供技术建议,了解密切接触者结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)现状。方法:2023年10月23日至11月14日在上海市奉贤区和金山区共选取140名肺结核密切接触者作为研究对象,对每名研究对象同时采用γ-干扰素释放试验(IGRA)和EC皮肤试验进行结核感染检测,采用Kappa值检验两种方法结果一致性,采用χ^(2)检验比较两组检测方法之间的差异,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:140名研究对象,包括男性55例,女性85例;IGRA阳性率为15.00%(21/140),EC皮肤试验阳性率为14.29%(20/140),两种试验方法一致性检验Kappa值为0.857,差异无统计学意义(χ^(2)=0.029,P=0.866),两种检测方法检测结果为高度一致性;以IGRA作为结核感染的参考标准,EC皮肤试验的敏感度为85.71%(18/21)、特异度为98.32%(117/119)、阳性预测值为90.00%(18/20)、阴性预测值为97.50%(117/120);男性EC阳性率(32.73%,18/55)明显高于女性(2.35%,2/85),差异有统计学意义(χ^(2)=17.983,P<0.001)。结论:EC皮肤试验具有较强的特异性,可用于肺结核密切接触者结核分枝杆菌感染筛查,但受限于使用年龄和接种禁忌证,可采用IGRA对无法进行EC皮肤试验者进行补充检测。

重组结核杆菌融合蛋白皮肤试验在肾透析患者诊断结核潜伏感染的应用价值

目的 评估重组结核杆菌融合蛋白(ESAT6-CFP10,EC)皮肤试验在肾透析患者中诊断结核潜伏感染的价值。方法 纳入某医院67例肾透析患者,同时接受结核菌素试验(the tuberculin skin test, TST)和γ-干扰素释放实验(interferon gamma release assay, IGRA),并以TST和Quanti FERON-TBgold(QFT,种IGRA方法)作为参照标准,衡量EC皮肤试验的灵敏度和特异度。结果 67例肾透析患者中,EC皮肤试验、TST、QFT阳性率分别为11.3%(7/62)、25.8%(16/62)、22.4%(15/67),差异无统计学意义(χ^(2)=4.051,P=0.105)。分别以TST、QFT、TST&QFT为参照标准,EC皮肤试验灵敏度分别为31.3%(95%CI:11.0%~58.7%)、50.0%(95%CI:23.0%~77.0%)、83.3%(95%CI:35.9%~99.6%),特异度分别为95.7%(95%CI:85.2%~99.5%)、100.0%(95%CI:92.6%~100.0%)、96.4%(95%CI:87.7%~99.6%)。结论 EC皮肤试验在肾透析患者中的结核潜伏感染诊断价值低于QFT,推荐使用QFT。

重组结核分枝杆菌融合蛋白皮肤试验与TST在学校结核潜伏感染筛查中的比较

目的 比较重组结核分枝杆菌融合蛋白皮肤试验(EC)与结核菌素皮肤试验(TST)两种检测方法的筛查效能及成本效益,探讨更适合学校结核潜伏感染的筛查方法。方法 选取2021年9月重庆市某中学高一新生共计283名,采用整群随机抽样方法分为EC组(138名)和TST组(145名),分别于左前臂皮内注射0.1 mL EC或0.1 mL TST,观察注射72 h后皮肤反应。皮肤试验前采集283名学生的静脉血,进行体外γ-干扰素释放试验(IGRA)检测,以IGRA检测结果为标准,分别计算EC、TST试验结果的灵敏度、特异度、漏诊率、一致率,并分析三者的成本效益。结果 EC的灵敏度、特异度、漏诊率、一致率分别为54.55%、93.70%、45.45%、90.58%;TST的灵敏度、特异度、漏诊率、一致率分别为61.11%、81.10%、38.89%、78.62%。每检出1例结核分枝杆菌感染者,TST、EC、IGRA的检测成本分别为124.29、492.86、4 879.31元。结论 EC与IGRA检测结果一致性较好,较TST的特异度和一致率更高,检测成本效益较高,简便易行,有望成为学校结核分枝杆菌潜伏感染新的筛查方法。

重组结核杆菌融合蛋白的临床综合评价

目的评价重组结核杆菌融合蛋白(EC)的有效性、安全性、经济性、创新性、适宜性和可及性,为遴选结核杆菌感染诊断和结核病辅助诊断的皮肤检测药品提供证据。方法采用系统评价法分析EC与结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)的有效性和安全性;以最小成本分析、成本-效果分析、成本-效用分析评价EC与TB-PPD的短期经济性,采用成本-效用分析评价两者的长期经济性;采用系统评价法、改良德尔菲专家咨询法确定创新性、适宜性和可及性评价的指标,通过各指标的权重计算EC和TB-PPD的各维度的综合评分。结果EC的有效性、安全性、经济性、创新性、适宜性评分均高于TB-PPD;两药的可负担性评分一致,EC的可获得性评分低于TB-PPD。考虑维度和指标权重后,EC的有效性、安全性、经济性、创新性、适宜性、可及性评分及其综合评分均高于TB-PPD。结论相较于TB-PPD,EC的有效性、安全性、经济性、创新性、适宜性和可及性均表现更优;但在可及性维度下,EC的可获得性应进一步改善。

重组结核杆菌融合蛋白对HIV感染人群结核潜伏感染效果评价

目的评价重组结核融合蛋白(EC)对艾滋病(HIV)感染人群结核潜伏感染(LTBI)的诊断价值。方法将EC注射在受试者的右前臂1/3处,结核菌素(PPD)注射于受试者左前臂1/3处,观察注射部位72小时后红晕和硬结直径的大小,判断是否为结核潜伏感染。结果对122例HIV/AIDs进行了2种方法的结核潜伏性感染(LTBI)筛查,PPD阳性人数31名,阳性率25.41%;EC阳性人数22名,阳性率18.03%;2两种筛查方法阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。2种筛查方法均为阳性21人,均为阴性90人,不一致11人,一致率90.98%,Kappa值0.737。结论重组结核杆菌融合蛋白对HIV人群筛查结核潜伏感染有一定的价值,该产品不受卡介苗疫苗接种的影响,且该产品特异度实优于TST,值得推广。

重组结核杆菌分泌融合蛋白活性鉴定及应用

目的研究融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10免疫学特性。方法将一个柔性的氨基酸接头插入原核表达载体pET32c(+)中,构建pET32c(+)-linker。PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因。将CFP10克隆入改建的载体pET32c(+)的linker前,ESAT-6克隆入linker后,构建CFP10-ESAT-6融合基因;或将ESAT-6克隆入改建载体pET32c(+)的linker前,CFP10克隆入linker后,构建ESAT-6-CFP10融合基因,分别转化大肠埃希菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠埃希菌BL21中表达,通过Westernblot分析其抗原性。结果2个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c(+)的linker前或后。重组质粒pET32c(+)-CFP10-ESAT-6或pET32c(+)-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。融合蛋白在BL21菌中高效表达。Western blot分析表明,融合蛋白与活性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应。结论成功地构建了多抗原基因DNA质粒;pET32c(+)-CFP10-ESAT-6或pET32c(+)-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白,该蛋白兼具CFP10和ESAT-6两种蛋白的抗原性。

重组结核杆菌融合蛋白(EC)的稳定性与有效性研究

目的考察重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,"EC"为重组融合蛋白"结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)"](以下简称"EC")原液的储存稳定性、成品储存及使用的稳定性与有效性。方法(1)原液储存稳定性研究:将3批次EC原液储存于-70℃,观察0~36个月,保存0、3、6、9、12、18、24、36个月时取样进行致敏效应试验、鉴别试验、效价检测,以及等电点、分子量、蛋白质含量、纯度(电泳法)等检测,其中致敏效应试验用豚鼠分为试验组(注射EC原液)与对照组(注射稳定剂),观察注射后动物反应,两组动物反应应无差异;鉴别试验为卡介苗致敏后豚鼠分别皮内注射EC原液和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD),观察测量豚鼠皮肤试验检测结果,EC原液皮肤试验应呈阴性反应(硬结或红晕平均直径<5mm),而TB-PPD皮肤试验应呈阳性反应(硬结平均直径≥5mm);效价检测为结核分枝杆菌活菌致敏后6只豚鼠分别皮内注射3个稀释度的EC原液及参考品,观察测量豚鼠皮肤试验检测结果,不同稀释度的EC原液与参考品皮肤试验局部反应的硬结或红晕平均直径总和的比值(以下简称"平均直径总和比值")应为1.0±0.2;等电点应为3.5~5.3,分子量应为(23±2.0)kDa(1kDa的相对分子质量为1000),蛋白质含量应不低于450.0μg/ml,纯度(电泳法)应不低于95.0%。(2)EC成品储存稳定性研究:成品分别储存于37℃和2~8℃,分别观察0~28d和0~36个月,37℃保存0、7、14、21、28d时、2~8℃保存0、3、6、9、12、18、24、36个月时取样进行鉴别试验、效价检测,以及pH值、苯酚含量等检测,其中鉴别试验方法及检测结果判定如"EC原液"。效价检测为结核分枝杆菌活菌致敏后4只豚鼠分别皮内注射EC成品及参考品,观察测量方法及平均直径总和比值判定如"EC原液",pH值应为6.8~7.4,苯酚含量应不高于3.0g/L。(3)EC成品使用稳定性研究:成品开启后分别放置于温度(25±2)℃、湿度(60±5)%和温度(40±2)℃、湿度(75±5)%两种条件考察使用过程的稳定性,观察时间为0~50min,分别于0、10、20、30、40、50min取样进行鉴别试验、效价检测,以及pH值、渗透压摩尔浓度等检测,试验方法和检测结果判定如"EC成品",其中渗透压摩尔浓度应为(280.0±68.0)mOsmol/kg。依据定期取样检测结果是否符合EC质量标准来判断产品稳定性,并为制定EC原液、成品有效期和成品使用时的有效时间提供依据。结果(1)EC原液-70℃观察0~36个月,在各研究时间点,致敏效应试验均表现为试验组与对照组动物反应无差异;鉴别试验结果为EC原液皮肤试验呈阴性,而TB-PPD皮肤试验呈阳性;效价检测结果为不同稀释度的EC原液与参考品皮肤试验的平均直径总和比值为0.9~1.1;等电点为3.7~5.2;分子量为(23.2~24.2)kDa;蛋白质含量为(501.6~616.7)μg/ml,纯度(电泳法)均为100.0%。(2)EC成品稳定性研究:在各研究时间点,鉴别试验结果为EC成品皮肤试验呈阴性,而TB-PPD皮肤试验呈阳性;效价检测结果显示EC成品与参考品皮肤试验的平均直径总和比值为0.9~1.0;pH值为7.1~7.4、苯酚含量为(2.6~2.9)g/L。(3)EC成品使用稳定性研究结果:在各研究时间点,鉴别试验结果均为EC成品皮肤试验呈阴性,而TB-PPD皮肤试验呈阳性;效价检测结果显示EC成品与参考品皮肤试验的平均直径总和比值均为1.0;pH值为7.1~7.2;渗透压摩尔浓度为(302.4~307.4)mOsmol/kg。结论EC原液-70℃储存36个月质量稳定;成品37℃储存28d、2~8℃储存36个月质量稳定;成品在开启后50min内使用,质量稳定。

重组结核杆菌融合蛋白(EC)用于诊断结核分枝杆菌感染的有效性和安全性系统评价

目的:系统评价重组结核杆菌融合蛋白(EC)相较于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)用于诊断结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染的有效性和安全性。方法:检索临床指南数据库、生物医学文献数据库、卫生行政部门和行业协会官方网站及不良反应监测官方网站,检索时间均自建库截止到2022年2月。英文检索词:Recombinant Mycobacterium tuberculosis fusion protein、CFP10/ESAT6;中文检索词:重组结核分枝杆菌融合蛋白、重组结核杆菌融合蛋白、宜卡、CFP10/ESAT6。收集重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)诊断MTB感染有效性和安全性的指南、共识、团体标准、系统评价和原始研究等。由2名研究者独立筛选文献、提取资料并评价纳入研究的偏倚风险,根据异质性大小采用Meta分析或描述性分析。结果:纳入指南2部、专家共识3篇、团体标准2部,均指出重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)可用于诊断MTB感染和结核病辅助诊断。纳入系统评价1篇,结果显示,重组结核杆菌融合蛋白(EC)皮肤试验共招募参与者887名,其敏感度为86.06%(95%CI:82.39%~89.07%)。纳入原始研究4篇,均为随机对照试验,有效性Meta分析结果显示,不区分人群,重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)的敏感度(89.3%vs.90.4%)和阴性似然比(0.177 vs.0.220)的差异无统计学意义,重组结核杆菌融合蛋白(EC)的特异度(85.5%vs.47.3%)、诊断比值比(42.238 vs.8.040)、阳性似然比(6.048 vs.1.710)、阳性预测值(66.0%vs.35.1%)、阴性预测值(96.2%vs.94.0%)优于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD),差异有统计学意义。安全性结果显示,重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)不良事件均为局部瘙痒和疼痛,均未发生严重不良事件。结论:重组结核杆菌融合蛋白(EC)可用于MTB感染诊断、辅助结核病诊断,相较于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD),其有效性表现更优。

重组结核杆菌融合蛋白(EC)的免疫特性和临床前安全性研究

目的通过对重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,"EC"为重组融合蛋白"结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)"](简称"EC")的免疫特性和临床前安全性研究,探讨其临床应用前景。方法(1)免疫特性研究:取6只雌性豚鼠,使用结核分枝杆菌H37Ra活菌菌液致敏,5周后,皮内注射2.5μg/ml EC原液0.2ml;取4只雌性豚鼠,使用卡介菌活菌菌液致敏,5周后,皮内注射20μg/ml EC原液0.2ml;观察注射部位平均硬结或红晕反应直径[(纵径+横径)/2],≥5mm判为阳性,<5mm判为阴性。(2)急性毒性试验:取80只ICR[(美国)Institute of Cancer Research]小鼠,分为单次肌内和皮内注射组,每组40只,雌雄各半;每组再分为4组,每组10只,雌雄各半。高剂量组(注射EC53.61μg/0.1ml)、低剂量组(注射EC 0.2μg/0.1ml)、溶剂对照组(注射EC稀释液0.1ml)、空白对照组(不给予任何受试物),观察小鼠的外观、运动功能、体质量、各脏器和药物注射部位皮肤等是否有异常。(3)豚鼠全身主动过敏试验:取豚鼠24只,分为4组,每组6只,雌雄各半,各组豚鼠分别隔日腹腔注射高剂量(5μg/kg)EC、低剂量(0.5μg/kg)EC、牛血清白蛋白(60mg)和0.9%NaCl(质量分数为0.9%的NaCl溶液)注射液(2ml),连续3次。致敏结束,末次致敏后第12天静脉快速注射2倍致敏剂量对以上相应的各组致敏豚鼠进行激发。致敏期间,每天观察豚鼠的症状,并于初次和最后一次致敏及激发当日测定每只豚鼠的体质量。(4)皮内刺激试验:取6只新西兰兔,单次皮内注射EC 10μg(0.2ml)/点,每侧5个点,观察皮内注射后的刺激反应情况。结果(1)免疫特性研究结果:EC原液对卡介菌活菌菌液致敏的4只豚鼠的皮肤试验,阳性为0只;EC原液对结核分枝杆菌H37Ra活菌菌液致敏的6只豚鼠的皮肤试验,阳性为6只。(2)急性毒性试验结果:所有小鼠未出现明显的急性中毒反应和显示急性中毒靶器官。小鼠皮内注射EC前、注射EC后1d、3d、5d、7d、8d、10d、12d、14d高剂量组、低剂量组小鼠平均体质量分别为(20.6±1.3)g^(24.9±2.1)g、(20.5±1.6)g^(26.0±3.1)g;注射后不同观察时间各组平均体质量与空白对照组[(21.0±1.1)g^(25.3±2.3)g]比较差异均无统计学意义(t值分别为0.571~0.392,0.695~0.615;P值分别为0.575~0.700,0.496~0.546);小鼠肌内注射EC前、注射EC后1d、3d、5d、7d、8d、10d、12d、14d高剂量组、低剂量组小鼠平均体质量分别为(21.0±1.5)g^(26.2±1.9)g、(20.5±2.1)g^(25.8±3.8)g;注射后不同观察时间各组平均体质量与空白对照组[(21.2±1.7)g^(25.8±3.1)g]比较差异均无统计学意义(t值分别为0.360~0.318,0.900~0.006;P值分别为0.723~0.754,0.380~0.995)。(3)豚鼠全身主动过敏试验结果:豚鼠无过敏反应。高剂量组、低剂量组豚鼠首次致敏、末次致敏、激发的平均体质量分别为(327.5±24.3)g、(347.2±32.7)g、(402.2±34.9)g;(331.3±26.7)g、(346.2±32.0)g、(411.3±38.9)g,与相应观察时间注射0.9%NaCl的阴性对照组[(329.5±27.4)g、(348.3±27.0)g、(399.4±25.4)g]比较,差异均无统计学意义(t值分别为0.328、0.181、0.284,0.474、0.366、0.875;P值分别为0.757、0.864、0.788,0.656、0.730、0.422)。(4)兔皮内刺激试验结果:单次皮内注射10μg(0.2ml)/点EC,无明显刺激反应。结论EC能够鉴别结核感染与卡介苗免疫,临床前动物试验安全性好,有望应用于人群结核感染的诊断与鉴别诊断。

重组结核杆菌融合蛋白(EC)产品质量标准的建立

目的建立重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,"EC"为重组融合蛋白"结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)";简称"EC"]原液及成品的质量标准。方法选取6批次EC原液及11批次EC成品、体质量300~400g无特定病原体(SPF)级白色豚鼠21只、卡介苗(BCG)活菌菌液(1mg/ml)、结核分枝杆菌减毒株H37Ra活菌菌液(2mg/ml)作为实验材料,建立EC原液质量标准,包括残余抗生素活性检测、致敏效应实验、效价测定及动物法鉴别实验;建立EC成品质量标准,包括鉴别实验及效价测定;应用建立的质量检测标准对连续6批次EC原液和11批次EC成品进行检测,验证其适用性和可行性。结果(1)EC原液残余抗生素活性检测。①专属性实验:磷酸盐缓冲液的吸光度值(A值)为1.736,卡那霉素标准品(0.0ng/ml)的A值为2.178;②线性与范围实验:卡那霉素标准品在0.5~40.5ng/ml范围内,连续3次实验回归方程拟合优度的判定系数R^2均大于0.99;③准确性实验:连续3批次EC原液的卡那霉素残留量回收率分别为112.163%、117.285%、103.527%;④重复性实验:连续3批EC原液重复性实验A值相对标准偏差(RSD)分别为5.59%、9.18%、8.07%;⑤中间精密度实验:同一实验员不同时间及不同实验员检测连续3批次EC原液卡那霉素残留量检测均小于定量限0.5ng/ml,为限量测定;⑥耐用性实验:改变读板时间(0、5、10min)对EC原液卡那霉素残留量检测无影响,卡那霉素残留量均小于定量限0.5ng/ml。(2)EC原液效价测定:稀释度为1μg/ml(5U/ml)、2.5μg/ml(12.5U/ml)、5μg/ml(25U/ml)及10μg/ml(50U/ml)时,每个稀释度对应的2批次EC原液动物皮肤试验的硬结或红晕平均直径及硬结或红晕平均直径总和比值分别为(15.17±0.88)mm、(13.67±1.25)mm、1.11(91.00/82.00);(17.00±1.76)mm、(16.08±1.32)mm、1.06(102.00/96.50);(19.58±1.69)mm、(17.67±1.37)mm、1.11(117.50/106.00);(20.75±1.57)mm、(20.25±1.17)mm、1.02(124.50/121.50)。(3)EC原液动物法鉴别实验:连续3批次EC原液动物皮肤试验的硬结或红晕平均直径均为0,TB-PPD动物皮肤试验的硬结平均直径为(15.13±5.06)mm。(4)EC成品鉴别试验:连续3个批次EC成品动物皮肤试验的硬结或红晕平均直径均为0,TB-PPD动物皮肤试验的硬结平均直径为(16.50±2.65)mm。(5)质量标准验证:①EC原液:残余抗生素活性检测结果均低于定量限0.5ng/ml;致敏效应实验结果均为皮肤试验后豚鼠注射部位局部反应无明显区别,也无全身反应;每个稀释度[2.5μg/ml(12.5U/ml)、5μg/ml(25U/ml)及10μg/ml(50U/ml)]在皮内注射后24h所产生的局部硬结或红晕反应平均直径均≥8mm,与相应稀释度参考品的局部硬结或红晕平均直径总和的比值为0.9±0.1;动物法鉴别实验结果为EC原液对BCG活菌致敏组豚鼠的皮肤试验结果均呈阴性反应(硬结或红晕平均直径<5mm),而TB-PPD呈阳性反应(硬结平均直径≥5mm)。②EC成品检测:各批次成品对BCG活菌致敏组豚鼠的皮肤试验均呈阴性反应(硬结或红晕平均直径<5mm),而TB-PPD呈阳性反应(硬结平均直径≥5mm)。结论所建立的质量标准可用于EC原液及成品的检定。

重组结核杆菌融合蛋白(EC)临床应用专家共识

中国是结核病高负担国家之一,结核病发病例数与潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)人数庞大,给我国结核病防控工作带来了巨大的挑战。有效识别结核病和LTBI对控制结核病疫情有重要意义。菌阴肺结核和LTBI的诊断依赖于结核感染的免疫学诊断方法;现行结核感染免疫学检测方法主要是结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST)、γ干扰素释放试验(interferon gamma release assays,IGRA)和抗原抗体检测。在现行的三类方法基础上,研发出了敏感度高、特异度强、试验操作简单、可用于LTBI和结核病诊断的新产品和新技术——重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,"EC"为重组融合蛋白"结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)"](简称"EC")。目前,已完成EC的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期临床试验。其中Ⅲ期临床试验中对1559名健康人群的筛查中发现,EC与IGRA的检测结果具有较高的特异度,且两者之间具有较高的一致性(88.77%);对791例临床诊断为结核病患者的临床研究发现,EC、结核感染T淋巴细胞斑点试验(T-SPOT.TB)、结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)检测均具有良好的敏感度,且三者之间具有较高的一致性;对479名未感染结核分枝杆菌人员的研究发现,EC与T-SPOT.TB的两次检测阴性一致率较高(88.20%和93.17%);在卡介苗接种对检测结果影响的研究中发现,EC和T-SPOT.TB基本不受卡介苗的影响;对394例临床诊断非结核性疾病患者的临床研究发现,EC与T-SPOT.TB阴性符合率较高,且一致性较好(87.21%)。基于EC在用于诊断结核感染安全且有效的基础上,EC通过了国家药品监督管理局药品审批而准予上市。经广泛征求有关结核病防控、临床和研究等领域的专家意见,在系统总结相关技术和方法的应用特点的基础上,结合EC的临床试验结果,形成了EC临床应用的专家共识。本共识介绍了EC的临床应用建议,包括使用对象、使用方法、结果判读,以及临床意义和使用范围。

重组结核分枝杆菌11 kDa蛋白皮肤试验与结核菌素皮肤试验的比较研究

目的比较重组结核分枝杆菌11 kDa蛋白(重组11 kDa蛋白)皮肤试验与结核菌素皮肤试验(PPD)两种检测方法,探讨更适合结核分枝杆菌潜伏感染者的筛查方法。方法选取2015年9月北京市大兴区某大学新生共461名,进行重组11 kDa蛋白和PPD的同体双臂皮肤试验,分别于不同前臂皮内注射0.1 mL重组11 kDa蛋白(10μg/L)和0.1 mL结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)(50 U/mL),观察注射后72 h后皮肤反应。于皮肤试验前采集461名志愿者的静脉血,进行体外γ干扰素释放试验(T-SPOT.TB)检测,采用T-SPOT.TB试剂盒进行。比较重组11 kDa蛋白皮肤试验、结核菌素PPD皮肤试验的差异性。结果以注射72 h后的硬结反应进行统计,2种检测结果显示男女阳性率比较,差异无统计学意义。重组11 kDa蛋白皮肤试验中阳性反应者为17名,阳性率为3.68%;PPD皮肤试验中强阳性反应者为8名,强阳性率为1.74%。以T-SPOT检测结果为标准,重组11 kDa蛋白皮肤试验灵敏度、特异度、准确度分别为39.53%,100.00%,94.36%;PPD皮肤试验灵敏度、特异度、准确度分别为16.28%,99.76%,91.97%。结论重组11 kDa蛋白皮肤试验灵敏度高,与体外T-SPOT.TB检测结果一致且简便易行,有望成为结核分枝杆菌潜伏感染的新的筛查方法。

重组结核杆菌融合蛋白（EC）获得新药生产注册受理

近日，安徽智飞龙科马生物制药有限公司自主研发的重组结核杆菌融合蛋白（EC）获得国家食品药品监督管理总局出具的《受理通知书》。

重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对不同分枝杆菌致敏豚鼠的皮试反应研究

目的研究重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对临床常见致病分枝杆菌及常见环境分枝杆菌致敏豚鼠的皮试反应。方法以鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏加分枝杆菌、龟分枝杆菌脓肿亚种、偶发分枝杆菌、草分枝杆菌、微黄分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌与卡介菌等16株菌株的活菌菌液分别经腹股沟皮下攻击豚鼠,每组5只,3～4周后,分别皮内注射TB-PPD、PPD-B和重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白各0.1ml,于注射后24、48h观察局部硬结的纵径与横径,根据48h的反应结果进行判定。结果PPD-B对16种分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮试硬结直径均≥5mm,呈阳性,阳性比例均为5/5;TB-PPD对结核、牛、非洲分枝杆菌和卡介菌等活菌致敏豚鼠的皮试硬结直径均≥5mm,呈阳性,阳性比例均为5/5;重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对结核、牛和非洲分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮试硬结直径均≥5mm,呈阳性,阳性比例均为5/5;而对鸟、胞内、蟾蜍、堪萨斯、海、瘰疠、戈登、苏加、龟脓、偶发、草、微黄和卡介菌等分枝杆菌活菌、结核分枝杆菌死菌致敏豚鼠的皮试反应均呈阴性,阳性比例均为0/5。结论重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白能提高结核分枝杆菌感染诊断的特异度并能区别结核分枝杆菌是否存活、卡介菌致敏导致的皮试超敏反应。

重组结核分枝杆菌11kDa蛋白鉴别潜伏性结核感染与卡介苗接种的研究

目的评价重组结核分枝杆菌11kDa(相对分子质量为11000)蛋白(简称"重组11kDa蛋白")在潜伏性结核感染筛查和卡介苗接种鉴别中的应用。方法由首都医科大学附属北京胸科医院联合北京市昌平区结核病防治所、北京市怀柔区结核病防治所和北京市大兴区结核病防治所,于2014年7月至2016年3月在以上3个区的高校和工厂招募健康志愿者。共计招募3001名志愿者,所有志愿者体检合格,均签订知情同意书。对所有志愿者采用Mantoux法进行重组11kDa蛋白和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)同体双臂皮肤试验,分别于不同前臂皮内注射0.1ml重组11kDa蛋白(10μg/ml)和0.1ml TB-PPD(50U/ml),观察注射后72h后的皮肤反应。于皮肤试验前采集所有志愿者的静脉血,进行体外γ-干扰素释放试验(IGRA)检测。采用"一致率(%)"和"一阶一致性系数(the first-order agreement coefficient,AC1)比较重组11kDa蛋白皮肤试验、TB-PPD试验及IGRA结果的差异。3001名志愿者均接受3种方法检测,其中475名3种检测结果均为阴性的受试者,采用数字表法按随机双盲的原则,以2∶1的比例接种卡介苗(318名;失访8例)和安慰剂(147名;失访2例),接种3个月后再次进行重组11kDa蛋白皮肤试验、TB-PPD皮肤试验及IGRA,采用"一致率(%)"和"AC1"比较其结果差异。结果健康志愿者潜伏性结核感染筛查中,IGRA阳性率(34.4%,1033/3001)明显高于重组11kDa蛋白(32.2%,966/3001),差异有统计学意义(χ^2=22.787,P<0.001);IGRA与重组11kDa蛋白的一致率为93.4%(2804/3001),AC1值为0.882(95%CI=0.866~0.898),两者有较好的一致性。TB-PPD阳性率(47.7%,1430/3001)明显高于重组11kDa蛋白(32.2%,966/3001),差异有统计学意义(χ^2=182.146,P<0.001);TB-PPD与重组11kDa蛋白的一致率为60.6%(1819/3001),AC1值为0.243(95%CI=0.207~0.279),两者的一致性较差。卡介苗接种鉴别研究中,接种卡介苗的志愿者重组11kDa蛋白的阳性率(1.3%,4/318)与IGRA(3.1%,10/318)比较,差异无统计学意义(χ^2=2.571,P=0.109);一致率为95.6%(304/318),AC1值为0.954(95%CI=0.929~0.979),两者有较好的一致性。重组11kDa蛋白的阳性率(1.3%,4/318)低于TB-PPD(56.3%,179/318),差异有统计学意义(χ^2=167.350,P<0.001);TB-PPD与重组11kDa蛋白的一致率为42.5%(135/318),AC1值为0.025(95%CI=-0.106~0.155),两者的一致性较差。接种安慰剂的志愿者重组11kDa蛋白的阳性率(4.1%,6/147)与IGRA(1.4%,2/147)比较,差异无统计学意义(χ^2=2.667,P=0.109);一致率为95.9%(141/147),AC1值为0.957(95%CI=0.921~0.993),两者有较好的一致性。TB-PPD的阳性率(17.7%,26/147)高于重组11kDa蛋白(4.1%,6/147),差异有统计学意义(χ^2=15.385,P<0.001),一致率为82.3%(121/147),AC1值为0.781(95%CI=0.690~0.871),两者有较好的一致性。结论重组11kDa蛋白在潜伏性结核感染筛查和卡介苗接种方面与IGRA有很好的一致性,可作为潜伏性结核感染者筛查与卡介苗接种鉴别的候选诊断试剂。

结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白克隆表达及血清学诊断价值

目的构建重组结核分枝杆菌38 kD-16 kD融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法通过聚合酶链反应扩增获得16 kD和38 kD基因片段,分别连接到表达载体pET21a中,同时将2片段2次连接到表达载体pET21a中,形成38 kD-16 kD(3 816),16 kD,38 kD重组载体;经表达、纯化和复性后,通过Western blot分析,以酶联免疫吸附试验检测184例血清抗体,肺结核患者96例、非结核肺部疾病患者50例,正常对照38例。结果成功构建重组质粒pET21a-3816,表达蛋白经SDS-PAGE后显示相对分子质量约为65 kD,重组蛋白经镍柱纯化后,纯度均达90%以上;经Western blotting证实重组蛋白能与结核病患者血清反应;重组蛋白3816血清检测,其敏感性为80.2%(77/96),特异性为90.9%(80/88)。结论成功表达和纯化了3816融合蛋白,其对血清学检测证明重组融合蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一。

月经期对结核菌素纯蛋白衍生物皮肤试验结果的影响

结核菌素纯蛋白衍生物（以下简称PPD）试验一直是用来诊断结核杆菌感染的一种重要方法,在结核病流行病学调查和监测、考核卡介苗接种质量、配合发现结核病人、选择预防治疗对象、辅助结核病的诊断和鉴别诊断等方面应用甚广[1]。为确定妇女月经期对试验结果的影响,我们进行了如下研究。报道如下：

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体—抗体融合蛋白致皮肤局部反应1例

患者,女,35岁,因强直性脊柱炎皮下注射重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（上海中信国健药业股份有限公司,批号：20111161）25mg/次,2次/周,第5次注射4h后,右侧上臂三角肌下缘出现8cm×6cm硬结,红、肿、痒,持续120h后逐渐消退.