重组羧肽酶B及其包涵体溶解性的研究

目的构建重组羧肽酶B(rCPB)的表达质粒和表达菌株,表达羧肽酶B(CPB),并对表达CPB包涵体的溶解性进行研究。方法构建CPB重组质粒pET-21a-CPB,将其导入表达菌株BL21(DE3)中,分别在25℃和37℃进行诱导表达;所得包涵体分别用不同浓度尿素添加不同还原剂溶解,以溶液中的蛋白质浓度判定其溶解性,利用非还原SDS-PAGE分析其溶解性提高的原因。结果诱导后生长温度不同对rCPB包涵体的纯度及后期处理均有影响;rCPB包涵体在10mol/L尿素溶液中的溶解度比在8mol/L尿素溶液中提高2￣3倍;添加0.75%β-巯基乙醇能显著改善rCPB包涵体的溶解效果。经非还原SDS-PAGE分析,添加β-巯基乙醇后,溶解rCPB聚体的含量减少。结论成功地表达了rCPB,并通过实验提高了rCPB包涵体的溶解度。

重组羧肽酶B的稳定性研究

目的筛选重组羧肽酶B(rCPB)酶液的保存方法以及rCPB的冻干保护剂。方法将添加和不添加甘油的两组rCPB酶液置于不同温度下保存,定期测定活力;在rCPB酶液中加入不同浓度的不同保护剂,比较冷冻干燥后的活性保留率,并从赋型性和溶解性方面评价冻干保护剂的作用。结果 4℃下,含25%甘油的rCPB酶液在6个月内活力保持不变;添加3%甘露醇和5%海藻糖的rCPB冻干品的酶活保留率分别为102%和100%。结论甘油能显著提高rCPB酶液的稳定性;从冻干保护效果和冻干品外观来评价,3%甘露醇可作为rCPB冻干过程中的最佳保护剂。

重组羧肽酶原B的体外变复性研究

重组羧肽酶原B在大肠杆菌中过量表达时形成包涵体,需要经过体 外变复性后才能获得生物活性．为了提高羧肽酶原B的复性效率,首先对包涵 体的溶解条件进行了优化．对比了极端pH条件、各种变性剂和一些表面活性剂 对包涵体的溶解效果;并且在较弱的碱性条件下得到了很好的包涵体溶解效果． 接着,通过对缓冲液中蛋白浓度、pH值、温度、氧化还原对(GSH:GSSG)比值 的定量分析,确定了复性液的基本成分;比较了不同浓度的尿素对防止聚集、提 高复性效率的影响;另外还对比了加样方式的影响,最终确定了重组羧肽酶原B 体外复性的最佳条件,即20 mmol／L Tris-HCl,pH=9．5,150μg／mL Pro- CPB concentration,1 mmol／L GSH,0．5 mol／L urea．复性效率比最初提高了3 倍左右．

重组羧肽酶原B突变体C383A的纯化与性质研究

目的纯化羧肽酶原B突变体C383A并研究其酶学性质。方法用DEAE-FF离子交换树脂纯化C383A,测定其动力学参数,温度对酶活性的影响、温度稳定性、最适pH以及pH稳定性等酶学性质,并与野生型比较。结果纯化后获得高纯度突变体C383A,与野生型相比,催化效率及稳定性均有提高,但与底物的亲和力降低,随着温度的上升催化速率的增长率低于野生型。结论将重组羧肽酶原B第383位Cys突变为Ala可对酶的性质产生影响,与野生型比较,C383A提高了酶的催化效率及温度和pH稳定性。

重组猪羧肽酶B的酶学性质及稳定性研究

目的研究重组猪羧肽酶B的酶学性质及稳定性。方法测定其酶学动力学参数Km和Vmax,最适pH和最适温度;研究不同pH和不同温度条件下酶的稳定性,以及金属离子和EDTA对酶的活性与稳定性的影响。结果重组猪羧肽酶B的Km为0.27 mmol/L,Vmax为222.22μmol/min,最适pH为7.65,最适催化温度为25℃;pH在5.0~9.0范围内,温度在4~30℃稳定性良好,Cu2+和EDTA抑制酶活性,Co2+促进酶活性。结论重组猪羧肽酶B的酶学性质与报道的提取猪羧肽酶B的性质基本相同,pH5.0~9.0范围内稳定,在4~30℃时稳定性好。

羧肽酶B研究进展

羧肽酶B是重组胰岛素生产中的一个必需工具酶,同时在蛋白质测序等领域中也得到广泛应用。文章综述了羧肽酶B的结构、测活方法、性质、稳定性及储存条件、提取方法、基因工程方法生产羧肽酶B的研究及重组羧肽酶B的性质等。

重组猪羧肽酶原B在大肠杆菌中的表达与复性研究

利用大肠杆菌表达系统,表达猪源羧肽酶原B蛋白包涵体,并对包涵体的体外复性条件进行优化。对猪源羧肽酶原B基因进行设计,优化稀有密码子,并将基因片段插入到pET28a载体中,构建表达质粒pET28a-proCPB,并转化入BL21(DE3)中。通过乳糖诱导表达得到包涵体。通过检测酶的比活力来考查复性液的pH、蛋白终浓度、氧化还原对比例、复性时间、复性温度对复性程度的影响。最终确定的体外稀释复性条件为:复性液成份为100mmol/L Gly-NaOH、pH=9.5、GSH与GSSG的比例为1∶0.8(GSH为1mmol/L)、蛋白终浓度为200μg/ml、复性温度为25℃、复性时间24h。通过检测,复性液中酶的比活力为11.7u/mg,经过DEAE纯化后酶的比活力可达到73u/mg。

Application of recombinant enzymes in the production of human insulin

In the present study, the cleavage activities of both recombinant and bovine enzymes （trypsin and carboxy peptidase B） were determined using proinsulin fusion protein. The proteolysis products were analyzed with HPLC. We found that recombinant enzymes had stronger activities and produced fewer by-products. In addition, recombinant enzymes were more efficient in the production of human insulin than bovine enzymes.