重组羧肽酶G2对甲氨蝶呤在Wistar大鼠体内代谢特征的影响

目的:建立灵敏稳定的高效液相色谱-二级质谱联用法(HPLC-MS/MS),用于同时测定Wistar大鼠血清中甲氨蝶呤(MTX)及其代谢产物2,4-二氨基-N10-甲基蝶酸(DAMPA)含量,并研究重组羧肽酶G2(CPG2)在健康大鼠体内对MTX的代谢特征的影响。方法:采用乙腈沉淀蛋白方法进行样品处理。采用HPLC-MS/MS进行分析。使用Thermo Hypersil GOLDC18(100 mm×2.1 mm,5#m)色谱柱,流动相A为水(含5 mmol.L-1乙酸铵,pH 3.5),流动相B为甲醇(含0.1%的甲酸),梯度洗脱(0～1.5 min,10%B;1.5～2 min,10%B→90%B;2～5 min,90%B;5～7 min,10%B),流速0.2 mL.min-1,柱温20℃;采用ESI+源,MRM离子检测模式,毛细管温度350℃,喷雾电压4.5 kV,鞘气压力172.4 kPa,辅气压力68.95 kPa,CollisionGAS(CAD)68.95 kPa,Curtain GAS(CUR)68.95 kPa,检测离子反应为MTX(m/z 455.2→308.1),DAMPA(m/z 326.1→175.1)。实验动物分为2组,尾静脉给药,单独给药组(MTX 350 mg.kg-1)和联合给药组(MTX 350 mg.kg-1给药5 min后给予CPG2 0.858 mg.kg-1),测定大鼠血清中MTX和DAMPA的浓度,并计算药代动力学参数。结果:血清中MTX和DAM-PA的线性范围均为5～1000 ng.mL-1(r>0.99),定量下限均为5 ng.mL-1。MTX的批内与批间精密度(RSD)为2.23%～14.29%,准确度(RE)为-2.83%～6.61%;DAMPA的批内与批间精密度(RSD)为1.78%～13.88%,准确度(RE)为-1.15%～7.00%。MTX和DAMPA的提取回收率范围分别为87.82%～95.09%和89.70%～96.21%,生物基质不干扰样品的测定,样品稀释后检测无稀释效应。本实验涉及条件下样品稳定。结论:建立的HPLC-MS/MS方法可用于测定大鼠血清样品中MTX及其代谢产物DAMPA的浓度,证实了CPG2在大鼠体内对MTX的酶解作用。