表达幽门螺杆菌外膜蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗菌对小鼠的免疫保护作用

为研究含pLAO的重组耻垢分枝杆菌疫苗(Recombinant Mycobacterium smegmatis,rM.S)对小鼠的保护作用。将重组耻垢分枝杆菌疫苗pLAO(MS)2×107灌胃免疫接种BALB/c小鼠,同时设PBS组、耻垢分枝杆菌空菌组,免疫4周后,各组处死一批小鼠,取胃组织待用;余下的小鼠用幽门螺杆菌标准株(Helicobacter pylori SS1,Hp SS1)攻击2次,4周后处死小鼠,进行胃组织快速尿素酶试验、Hp培养、炎症程度及其炎症活动度评分,以评价疫苗对胃黏膜Hp感染的免疫保护作用,ELISA检测Hp特异性血清IgG和IgA水平。结果表明疫苗组Hp定植评分均明显低于PBS组和空菌组,疫苗组不仅可以降低Hp的定植,而且能减轻Hp造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎症反应。免疫后BALB/c小鼠特异性抗体显示rM.S疫苗诱导的Hp特异性血清IgG、IgA水平都升高。因此rM.S疫苗经灌胃接种BLAB/c小鼠能降低Hp定植,减轻胃黏膜的炎症反应,对Hp感染有明显的预防保护作用。

结核分枝杆菌重组耻垢分枝杆菌疫苗的研究进展

结核分枝杆菌引起的结核病是一种人兽共患的慢性传染病,短程督导化疗是治疗该病的主要措施,卡介苗是预防该病的唯一疫苗,但其免疫效果极不稳定。文章介绍了4种结核分枝杆菌重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建及其免疫机制等方面的研究进展。

猪囊尾蚴特异性抗原cC1重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建与鉴定

目的构建表达猪囊尾蚴cC1抗原的重组耻垢分枝杆菌疫苗。方法提取pET28a-cC1质粒DNA,用xho I和BamH I双酶切,用Klenow酶补平xho I酶切末端,同时提取pMV261穿梭质粒载体,用Hind III和BamH I双酶切,用Klenow酶补平Hind III酶切末端,纯化后的酶切产物通过T4连接酶连接,构建pMV261-cC1穿梭质粒,测序验证正确后,将pMV261cC1穿梭质粒经电穿孔法转化耻垢分枝杆菌,构建重组耻垢分枝杆菌,经热诱导后,以猪囊尾蚴病患者血清为一抗进行Western-blotting鉴定。此外,比较正常耻垢分枝杆菌和重组cC1耻垢分枝杆菌生长状态并绘制生长曲线。结果构建的重组穿梭载体经酶切、测序验证正确。构建的重组耻垢分枝杆菌经热诱导后,SDS-PAGE电泳分析显示,在40 kDa处有外源性蛋白表达,与预期值相符。Western-blotting显示其可被猪囊尾蚴病患者血清识别,表明cC1抗原基因在耻垢分枝杆菌中表达成功。重组耻垢分枝杆菌与正常耻垢分枝杆菌的增殖特性无明显差异。结论成功构建了表达猪囊尾蚴特异性抗原cC1的重组耻垢分枝杆菌疫苗。

猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗诱导小鼠免疫应答

目的观察猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,MS)疫苗免疫小鼠诱导产生的体液和细胞免疫应答。方法SPF级昆明小鼠60只(18~22 g,雌雄各半),采用随机数字表法分为3组,每组20只,分别为重组MS-TSOL18疫苗组、MS对照组、磷酸盐缓冲液(PBS)对照组。采用口服灌胃法免疫2次,间隔2周。于免疫后0、2、4、6、8周,每周4只小鼠眼眶静脉取血,分离血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测小鼠血清IgG与IgG2a水平;无菌取脾,制备脾淋巴细胞悬液,采用CCK-8法检测脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后增殖水平,采用ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后产生白细胞介素(IL)-2和IL-4的水平。结果与MS对照组(IgG:0.160 ± 0.019、0.187 ± 0.038、0.193 ± 0.050、0.170 ± 0.005,IgG2a:0.213 ± 0.010、0.198 ± 0.012)和PBS对照组(IgG:0.159 ± 0.015、0.184 ± 0.029、0.191 ± 0.025、0.165 ± 0.018,IgG2a:0.198 ± 0.032、0.178 ± 0.025)比较,重组MS-TSOL18疫苗组小鼠血清特异性IgG水平(0.310 ± 0.034、0.391 ± 0.029、0.443 ± 0.030、0.373 ± 0.021)在免疫后2、4、6、8周升高(P均< 0.05),lgG2a水平(0.446 ± 0.056、0.339 ± 0.026)在免疫后6、8周升高(P均< 0.05),6周时均达峰值。抗原刺激后,与MS对照组和PBS对照组比较,重组MS-TSOL18疫苗组小鼠脾淋巴细胞增殖水平在免疫后2、4、6、8周升高(P均< 0.05),在6周时达峰值。抗原刺激后,与MS对照组和PBS对照组比较,重组MS-TSOL18疫苗组小鼠脾淋巴细胞培养上清液中IL-2和IL-4水平均在免疫后2、4、6、8周升高(P均< 0.05),分别在6周和4周时达峰值。结论猪带绦虫TSOL18重组MS疫苗免疫可诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答。

猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建及其表达

目的构建猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗,分析猪带绦虫TSOL18基因在重组耻垢分枝杆菌中的表达情况。方法采用PCR方法从重组质粒pGEX-TSOL18中扩增TSOL18基因,克隆入pMV361载体,构建pMV361-TSOL18穿梭质粒,经酶切和测序鉴定后电穿孔法转化入耻垢分枝杆菌,进行单克隆菌落筛选及PCR鉴定。构建的猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗经热诱导后,以SDS-PAGE分析及Western blot分析TSOL18基因在重组耻垢分枝杆菌中的表达情况。结果成功扩增出TSOL18目的基因,大小约为393 bp,与预期值相符;经酶切验证,pMV361-TSOL18穿梭质粒构建成功;PCR鉴定猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗构建成功。SDS-PAGE电泳检测重组菌表达的目的蛋白TSOL18,相对分子质量为15×10^3与预期相符;Western blot分析该蛋白能被TSOL18兔抗血清识别。结论成功构建了猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗,猪带绦虫TSOL18基因在耻垢分枝杆菌中成功表达,表达蛋白具有反应原性,其免疫原性有待进一步研究。

重组耻垢分枝杆菌-Sj26GST疫苗的免疫保护作用研究

目的 初步研究重组耻垢分枝杆菌疫苗 r Mc- Sj2 6 GST (recom binant M.smegmatism c2 1 5 5 - Sj2 6 GST)对小鼠的免疫保护作用。方法 用耻垢分枝杆菌重组疫苗 r Mc- Sj2 6 GST免疫雄性 BAL B/ c小鼠 ,检测小鼠淋巴细胞刺激指数 (SI) ,腹腔巨噬细胞培养上清释放 NO量 ,小鼠血清IFN- γ、IL- 2的含量 ,并计数小鼠肝、肺活细菌数。结果 小鼠脾淋巴细胞刺激指数 (SI)为 2 .6 4±1 .37,与 Mc组 (载体组 ) 1 .2 8± 0 .4 1相比 ,差异具有显著性 ;小鼠血清 IFN- γ为 1 96 .4 3pg· ml- 1 ,与 Mc组 1 1 2 .5 7pg· ml- 1相比 ,差异有显著性 ,较对照组高 4 1 % ;小鼠血清中 IL- 2的浓度较对照组高。经 r Mc- Sj2 6 GST疫苗免疫的小鼠受结核杆菌攻击后其肺、肝脏结核杆菌数较对照组少。结论 耻垢分枝杆菌重组疫苗 r Mc- Sj2 6 GST增强了小鼠细胞免疫功能 。

重组耻垢分枝杆菌-Sj26GST疫苗有关毒性实验研究

目的初步研究重组耻垢分枝杆菌-Sj26GST疫苗对小鼠的有关毒性作用。方法 用重组耻垢分枝杆菌-Sj26GST疫苗免疫雄性BALB/c小鼠,16周后,称小鼠体重,摘眼球取血,测定小鼠的淋巴细胞、血红蛋白、白细胞及血小板含量;剩余血离心得到血清,测定小鼠肌酐及ALT;处死小鼠,分离出肺、肾、肝,并分别测定其重量。结果重组耻垢分枝杆菌-Sj26GST疫苗免疫的小鼠,其淋巴细胞数较对照组高(P<0.05),且在正常范围之内;小鼠体重、各脏器重量、各血象指标及血清肌酐和ALT含量与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。结论重组耻垢分枝杆菌-Sj26GST疫苗免疫小鼠后对小鼠无系统毒性作用。

细粒棘球绦虫EgM123重组耻垢分枝杆菌疫苗在小鼠体内的表达及其免疫应答

目的构建表达细粒棘球绦虫成虫特异性基因EgM123的耻垢分枝杆菌疫苗株,接种BALB/c小鼠,观察其免疫原性。方法 PCR扩增EgM123片段,定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261中,构建重组质粒pMV261-EgM123。连接产物转化至大肠埃希菌DH5α中,培养后提取质粒,测序确定阅读框架正确,后电穿孔转入耻垢分枝杆菌,构建表达EgM123的重组耻垢分枝杆菌疫苗(rMS-EgM123),经热诱导后采用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白表达。在培养过程中连续检测菌液A600值,绘制重组菌生长曲线。取重组菌接种小鼠,检测基础接种和加强免疫接种后血清特异抗体水平。结果 PCR扩增出大小为594bp的EgM123片段,EgM123基因正确插入到穿梭质粒pMV261中,测序鉴定阅读框架正确。重组耻垢分枝杆菌连续传10代培养,重组质粒DNA序列未发生变异。Western blot检测表达产物能被抗EgM123鼠血清识别。用重组耻垢分枝杆菌疫苗加强免疫后的小鼠血清特异性抗体呈持续上升趋势,单次加强免疫8周后抗体水平(A405值为2.504±0.659)显著高于亚单位疫苗组(P<0.05)。结论重组耻垢杆菌疫苗菌能表达细粒棘球绦虫成虫EgM123蛋白,且该重组疫苗可通过加强免疫增强基础免疫诱导小鼠产生的抗体水平。

无细胞耻垢分枝杆菌疫苗的Ⅰ期临床研究

目的:通过Ⅰ期临床研究探讨无细胞耻垢分枝杆菌疫苗(M.S疫苗)的人群安全性和耐受性,并初步观察该疫苗对结核病高危人群皮试反应强度的影响。方法:给55例健康志愿者注射不同剂量的疫苗(8.7,17.5和35.0μg),每例注射6次,每2周注射1次。通过对受试者的随访、心率和血压测试、血液常规、尿液常规、肝功能、胸部X-片以及肝、胆、脾、胰的B超检查以及PPD皮肤试验,评估M.S疫苗的不良反应,并比较疫苗注射前后PPD反应强度的变化。结果:在55例、330例次M.S疫苗注射过程中,发生14例、17例次的轻度不良反应,包括局部疼痛、淋巴结肿大、发热、局部硬结、心慌、皮疹和乏力,轻度不良反应总发生率为25.5%(14/55),未发生中度及重度不良反应;PPD皮试强阳性者经不同剂量M.S疫苗的注射,PPD皮试反应强度均显著降低(P<0.05)。结论:M.S疫苗具有较高安全性,并可显著降低结核病高危人群PPD皮试反应的强度。

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT-6融合蛋白重组耻垢分枝杆菌对小鼠的免疫原性研究

目的评价表达Mtb Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Ag85B-ESAT-6-rM.s)在小鼠中的免疫原性。方法6周龄BALB/c小鼠经背部皮下注射1×106 CFU(colony-forming unit,菌落形成单位)的Ag85B-ESAT-6-rM.s,同时设M.s免疫组(10只)、BCG免疫组(10只)、Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫组(10只)和生理盐水组(10只)。接种免疫后1～6周,尾静脉采血,检测小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞所占百分比;免疫后6周,MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,innersalt]法检测小鼠脾淋巴细胞增殖和酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)检测脾淋巴细胞分泌γ干扰素(interferonγ,IFN-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)等细胞因子的水平。结果Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠后能够明显刺激小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞的产生,其所占百分比[(59.6±1.5)%]明显高于BCG免疫组[(48.8±2.3)%](t=12.252,P<0.05)和原始M.s免疫组[(45.7±1.6)%](t=20.166,P<0.05)。Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖指数(3.23±0.31)与BCG免疫刺激的增殖指数(2.95±0.36)相当(t=1.864,P>0.05),但其诱生IFN-γ的能力[斑点形成细胞(spotforming cells,SFC)][(167.5±36.6)SFC/106]明显高于BCG[(98.5±26.9)SFC/106](t=4.804,P<0.05)。结论Ag85B-ESAT-6融合蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达能够明显提高M.s的免疫原性,并能够刺激小鼠机体产生有利于抗Mtb感染的免疫反应,作为TB新型候选疫苗具有一定的研究前景。

表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV-ESAT6,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc2155中。以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组(P<0.05)。结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础。

结核分枝杆菌肝素结合血凝素与人IL12融合基因重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

目的构建表达肝素结合血凝素与人IL12融合基因的重组耻垢分枝杆菌并对其进行鉴定。方法通过RT-PCR从人淋巴细胞获得hIL12基因模板,采用PCR技术克隆hIL12的P40和P35两个亚基及结核分枝杆菌的HBHA基因,通过酶切鉴定及DNA测序证实连接的基因片段均正确后,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pSMT3-HBHA-hIL12,并用电穿孔法将重组质粒转到耻垢分枝杆菌中。分别用HBHA单克隆抗体和hIL12多克隆抗体检测HBHA和hIL12蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达,并测定重组耻垢分枝杆菌生长状态的改变。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,通过HBHA单抗和hIL12多抗进行免疫荧光法检测证实HBHA和hIL12均有表达,并且重组的耻垢分枝杆菌的生长速度比正常组有较大的提高。结论成功构建了表达结核分枝杆菌HBHA基因和人IL12的重组耻垢分枝杆菌,为构建一种结核病的候选疫苗提供了实验基础。

耻垢分枝杆菌疫苗对小鼠巨噬细胞产生一氧化氮的影响

目的探讨耻垢分枝杆菌疫苗对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮的影响。方法将Balb/c小鼠随机分成生理盐水对照组和耻垢分枝杆菌疫苗低、中、高剂量组,分别注射生理盐水和不同剂量的耻垢分枝杆菌疫苗。取小鼠腹腔巨噬细胞体外培养,化学显色法测定培养上清中一氧化氮的含量。结果生理盐水对照组和耻垢分枝杆菌疫苗低、中、高剂量组产生的一氧化氮分别为(3.50±3.11)、(16.63±6.47)、(13.97±6.20)和(7.55±2.26)ng/ml,不同剂量疫苗免疫小鼠产生的一氧化氮水平均显著高于对照组(P<0.01)。结论耻垢分枝杆菌疫苗可促进小鼠巨噬细胞产生一氧化氮。

表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗作用

评价表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌用于结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗效果。结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠4周后,用表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫治疗,检测免疫小鼠肺部荷菌量和组织病理变化。重组耻垢分枝杆菌可有效控制感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量,减轻病理损伤。但在降低肺部荷菌量方面不如化疗药物。表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌可有效控制结核分枝杆菌在小鼠体内的增殖,可能成为联合化疗药物控制结核病的有效候选疫苗。

利用分枝杆菌的重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌的方法研究

目的利用pJV53质粒编码的分枝杆菌重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组。方法将pJV53质粒转入耻垢分枝杆菌,使其表达重组蛋白,制备带有重组蛋白的感受态细胞;从质粒pBS1479中扩增出tap片段,从质粒pSMT3中扩增hyg片段,从耻垢分枝杆菌基因组中分别扩增出aasf基因及其5′端非编码区片段AASF5和aasf基因下游3′端非编码区片段AASF3,利用重叠PCR将以上4个片段拼接在一起,形成最终的敲入片段A5THA3;将构建好的敲入片段转入感受态细胞,使其重组入耻垢分枝杆菌基因组中,PCR和DNA测序鉴定敲入效果。结果重叠PCR技术得到全长为3 200 bp的敲入片段,PCR与DNA测序结果证实带有TAP标签的A5THA3片段已成功敲入耻垢分枝杆菌基因组中。结论成功将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组,为下一步进行目的基因功能研究奠定了基础。

重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病免疫治疗效果的评价

目的评估携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染的治疗效果,及其与临床抗痨药物疗效的比较。方法结核分枝杆菌H37Rv感染Balb/c小鼠4周后分别用生理盐水、GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌(重组M.S)I、NH+PZA和重组M.S+INH+PZA治疗,于第1次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-γ分泌水平、肺泡灌洗液SIgA的水平和肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果重组M.SI、NH+PZA和重组M.S+INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量(logCFU/g)比生理盐水组显著降低。重组M.S组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组。重组M.S组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于其它组。各组产生黏膜特异性SIgA明显高于未经感染组。用免疫组化检测到小鼠肺及脾组织中GLS的表达。生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛,正常肺泡结构被破坏;其余组肺组织病变轻且局限。结论重组M.S对小鼠结核病有一定免疫治疗作用,通过增强宿主Th1型免疫应答和GLS的抗菌活性有关;重组M.S对临床常用的抗结核药有协同作用,为结核病的综合治疗打下实验基础。

无细胞耻垢分枝杆菌疫苗对豚鼠的长期毒性研究

目的:观察无细胞耻垢分枝杆菌疫苗对豚鼠的长期毒性。方法:48只豚鼠随机均分成无细胞耻垢分技杆菌疫苗低、中、高剂量组(疫苗用量分别为50,250和500μg·kg-1)和阴性对照组,每周1次,连续7周肌内注射疫苗,阴性对照组给予等体积的生理氯化钠溶液。在实验前、中、末期(n=12)和恢复期(n=4)观察动物体重、白蛋白和球蛋白比值、抗疫苗抗体IgG和总IgE的含量;在实验末期和恢复期对豚鼠作病理组织学检查和骨髓细胞学检查。结果:阴性对照组豚鼠抗疫苗抗体IgG始终为阴性,疫苗组豚鼠注射疫苗后抗疫苗抗体IgG阳转;各组豚鼠在整个实验过程中体重稳定增加,白蛋白和球蛋白比值未见明显改变,血清IgE均为阴性;各脏器未见病理性损害和免疫复合物沉积,各脏器系数与阴性对照组比较未见统计学差异;骨髓各系造血细胞未见抑制现象。结论:无细胞耻垢分枝杆菌疫苗对豚鼠无长期毒性。

无细胞耻垢分枝杆菌疫苗对结核杆菌感染者的预防作用研究

目的初步探讨无细胞耻垢分枝杆菌疫苗对结核杆菌感染者的预防作用。方法1.动物实验:将结核杆菌感染的豚鼠随机分为不同剂量的无细胞耻垢分枝杆菌疫苗组(A组:7.0μg/次,B组:35.0μg/次)和阴性对照组(C组),观察疫苗对豚鼠PPD皮肤反应、病变指数和活菌负荷的影响。2.人体试验:将31名PPD皮试强阳性者随机分为不同剂量的无细胞耻垢分枝杆菌疫苗组(D组:8.7μg/次、E组:17.5μg/次、F组:35.0μg/次),观察受试者注射疫苗前后PPD皮肤反应情况。结果1.动物实验:A、B、C组豚鼠PPD皮肤反应强度依次为(9.87±3.36、7.04±3.09、12.67±1.47)mm,A组、B组和C组比较,均有极显著性差异(P<0.01);A、B、C组豚鼠病变指数依次为34.6±13.7、29.6±12.3、49.6±16.7,A组、B组和C组比较,均有显著性差异(P<0.05);A、B、C组豚鼠脾脏分离的结核杆菌对数值依次为4.32±1.58、4.00±1.39、4.94±0.41,B组和C组相比有显著性差异(P<0.05)。2.人体实验:D、E、F组受试者注射疫苗前PPD皮试结果依次为(36.1±4.5、34.0±3.6、33.5±3.1)mm,注射疫苗后PPD皮试结果依次为(20.6±0.6、16.0±1.6、17.82±1.2)mm,各组注射疫苗前后PPD皮试结果比较均有显著性差异(P<0.05)。结论无细胞耻垢分枝杆菌疫苗对结核杆菌感染者有较好的预防效果。

耻垢分枝杆菌疫苗经灌胃免疫在小鼠体内的分布与安全性研究

目的探讨携带编码幽门螺杆菌UreB基因质粒(pLUB)的重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.s)经灌胃免疫在小鼠体内的分布和安全性。方法将携带绿色荧光蛋白(GFP)基因质粒(pLUB)的重组耻垢分枝杆菌灌胃BALB/c小鼠后8周,处死小鼠,观察胃、心、肝、脾、肺和肾组织中荧光蛋白的分布,测定小鼠肌酐及ALT;处死小鼠,分离出肺、肾、肝并分别测定其重量及HE染色。结果在BALB/c小鼠胃、脾组织中均检测到绿色荧光蛋白的表达,其他组织及对照组未检测到绿色荧光;小鼠体质量、各脏器质量、各血清肌酐和ALT含量与对照组无差异(P>0.05)。结论携带GFP的重组耻垢分枝杆菌可在胃和脾组织分布,对小鼠无系统毒性作用。

融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠的免疫应答及其保护力

目的研究融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导的小鼠体液和细胞免疫应答水平。方法以106CFU/0.1 mL重组M.S通过尾静脉途径免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。结果融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6 400。淋巴细胞刺激增殖指数为2.8,明显高于生理盐水组(0.90);IFN-γ和IL-2的含量分别为2230±11 pg/mL和221±17 pg/mL,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时重组耻垢分枝杆菌诱导的脾细胞杀伤率为45%。结论融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌能诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,可作为结核新型疫苗使用。