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重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条快速检测新加坡石斑鱼虹彩病毒
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作者 潘莹 杨家辉 +3 位作者 彭发永 黄友华 秦启伟 黄晓红 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期105-115,共11页
为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的方法,本研究针对SGIV特异基因ORF014L序列设计特异性引物及探针,建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplificati... 为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的方法,本研究针对SGIV特异基因ORF014L序列设计特异性引物及探针,建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)(RPA-LFD)的SGIV检测技术。RPA反应使用10μmol/L的引物浓度,在40.1℃恒温反应20 min即可完成特异性病毒的检测,最低检测限为102个/μL标准质粒。RPA-LFD反应在42℃恒温反应8 min可将检测结果通过试纸条可视化呈现,最低检测限为101个/μL标准质粒,且不与其他常见水生动物病原发生交叉反应,临床样品检测结果也与PCR检测结果一致。RPA、RPA-LFD均能特异性检测SGIV,两者的检测限均比常规PCR灵敏。RPA-LFD法具有快捷简单、结果可视化的特点,在临床应用具有较好的应用前景。 展开更多
关键词 新加坡石斑鱼虹彩病毒 ORF014L基因 重组聚合 层析试纸 可视化
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芋疫霉重组聚合酶扩增结合侧流层析试纸条快速检测方法的建立及应用 被引量:1
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作者 王荣波 陈姝樽 +3 位作者 赵玉梅 李本金 刘裴清 陈庆河 《植物保护学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期1654-1662,共9页
为建立芋疫霉Phytophthora colocasiae快速准确的分子检测方法,基于Ypt1基因特异序列,设计芋疫霉的特异性引物与探针,建立一种快速、准确、可视化的芋疫霉重组聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-later... 为建立芋疫霉Phytophthora colocasiae快速准确的分子检测方法,基于Ypt1基因特异序列,设计芋疫霉的特异性引物与探针,建立一种快速、准确、可视化的芋疫霉重组聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测方法,对该检测方法进行优化,评估其特异性与灵敏度,并对田间疑似样品进行检测。结果表明,优化后的芋疫霉LFD-RPA检测方法最适反应条件为39℃恒温反应30 min。LFD-RPA检测方法能够特异性地检测出芋疫霉,而对其他卵菌近缘种和常见植物病原真菌均未检出,且该检测方法对芋疫霉DNA的检测灵敏度达到1 pg/μL。对田间带病组织检测发现,LFD-RPA检测方法能够快速准确地从田间自然发病植株中检测出芋疫霉。表明本研究所建立的芋疫霉LFD-RPA快速可视化检测方法特异性好、灵敏度高、简单快捷,可用于芋疫病的田间快速诊断。 展开更多
关键词 芋疫霉 重组聚合酶扩增结合侧流层析试纸条 Ypt1基因 快速检测
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塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测方法的建立 被引量:16
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作者 樊晓旭 宋翥远 +11 位作者 赵永刚 赵明 董雅琴 张永强 李园丽 迟田英 刘春菊 戈胜强 张志诚 吴晓东 王树双 王志亮 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期406-410,共5页
为建立塞尼卡谷病毒(SVV)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对SVV 3D基因设计了引物和探针,通过反应条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了SVV RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法与口蹄疫病... 为建立塞尼卡谷病毒(SVV)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对SVV 3D基因设计了引物和探针,通过反应条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了SVV RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒无交叉反应;在40℃、20 min内可检测的最低浓度为56拷贝/μL质粒标准品;通过3次重复试验检测,LFD检测线灰度值变异系数范围在4.49%~9.73%。利用该方法对120份国内临床样品进行检测,结果均为阴性。本研究首次建立了检测SVV的等温、快速RPA-LFD方法,读取结果不依赖任何仪器设备,为猪群感染SVV的现场快速诊断、流行病学研究和根除方案的制定提供帮助。 展开更多
关键词 塞尼卡谷病毒 重组聚合 试纸
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重组酶聚合酶扩增反应结合侧流层析试纸条技术快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪 被引量:1
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作者 王慧芳 喻勇新 +3 位作者 李晨虹 陈文隽 凌岚馨 周颖 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2022年第17期291-297,共7页
建立了重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification,RPA)结合侧流层析试纸条技术(RPA-lateral flow dipstick,RPA-LFD)快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪的方法。对比大西洋鳕鱼和常用来冒充鳕鱼的鱼类线粒体基因组序列,设计... 建立了重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification,RPA)结合侧流层析试纸条技术(RPA-lateral flow dipstick,RPA-LFD)快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪的方法。对比大西洋鳕鱼和常用来冒充鳕鱼的鱼类线粒体基因组序列,设计针对大西洋鳕鱼的特异性探针和引物,建立针对大西洋鳕鱼的RPA-LFD检测方法。该实验筛选最佳引物和探针并评估其特异性,优化反应温度、时间和现场检测条件,并对20份市售“大西洋鳕鱼”及常见的冒充鳕鱼的鱼类制品进行现场检测,评估检测效果。实验结果表明,RPA-LFD检测方法特异性强,在44℃、14 min条件下的检测效果最好。在现场开展快速检测,效果良好,20份鳕鱼制品检测结果经过基因测序证实和产品真实成分一致。该研究建立的大西洋鳕鱼RPA-LFD检测方法特异性强、反应耗时短、操作简便、结果可视,有良好的现场快速检测应用前景,为大西洋鳕鱼制品现场快速检测提供了新思路,为水产品市场监管提供了技术支持。 展开更多
关键词 大西洋鳕鱼 重组聚合反应 真伪 层析试纸技术 现场快速检测
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基于重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条快速检测鲤疱疹病毒2型的方法研究
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作者 韩进刚 王菁 +3 位作者 徐赟霞 刘群 罗璋 冯守明 《河北渔业》 2022年第6期29-34,共6页
为建立CyHV-2的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析(RPA-LFD)快速检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的方法,针对鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因设计引物和探针,优化反应温度和时间条件,建立了鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法... 为建立CyHV-2的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析(RPA-LFD)快速检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的方法,针对鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因设计引物和探针,优化反应温度和时间条件,建立了鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法,并将样品简易处理方法运用于该方法对实验室保存的鲫组织样品进行检测。结果显示,该RPA-LFD检测方法最佳反应条件为40℃20 min,最低检出限为6×10^(0) copies/μL,与荧光PCR的灵敏度相当,与其他鲤疱疹病毒等无交叉反应;运用该方法并结合待检样品简易处理方法(直接RPA法)对50份鲫组织样品进行处理和检测,其结果与运用国家标准(GB/T 36194-2018)中荧光PCR方法检测结果一致。本文建立的RPA-LFD检测方法具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、特异性强的优点,适于在水产养殖场和基层部门用于鲤疱疹病毒病的辅助诊断和监测。 展开更多
关键词 鲤疱疹病毒2型(CyHV-2) 重组聚合(RPA) 层析试剂(LFD) 直接RPA法
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双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术结合核酸杂交侧流条快速检测牛肉中的鸡、鸭、猪源性成分
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作者 曹婷婷 袁毅 +1 位作者 王晶 柳海宾 《食品安全质量检测学报》 CAS 北大核心 2023年第15期119-128,共10页
目的 建立双拖尾重组聚合酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合核酸杂交侧流条(nucleic acid hybridization-lateral flow strip, NAH-LFS)快速检测牛肉中鸡源、鸭源、猪源性成分的可视化检测技术。方法 采用多重... 目的 建立双拖尾重组聚合酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合核酸杂交侧流条(nucleic acid hybridization-lateral flow strip, NAH-LFS)快速检测牛肉中鸡源、鸭源、猪源性成分的可视化检测技术。方法 采用多重双拖尾RPA技术与NAH-LFS相结合,对鸡、鸭、猪线粒体D环区域设计特异性拖尾RPA引物,扩增出双拖尾的RPA产物。鸡、鸭、猪3个物种RPA产物的拖尾序列分别与红、黄、蓝3种颜色的金纳米探针和侧流条上的检测探针杂交。结果 鸡、鸭、猪3个物种RPA产物与探针杂交后形成肉眼可见的红、黄、蓝3色条带,整个RPA扩增(15 min)和侧流条检测(5 min)过程在20 min内即可完成。该方法对牛肉中鸡、鸭、猪肉的检出限达0.01%,且仅对鸡、鸭、猪肉DNA有特异性,与其他10个物种的DNA均无交叉反应。采集50份市售牛肉样品,使用该方法进行真实性检测:10份牛肉干、10份生牛肉、10份酱牛肉中未检测出其他动物源性成分, 10份牛肉馅料中检测出1份含猪源性成分, 10份牛肉片中检测出1份含鸡源性成分。该方法与聚合酶链式反应结合凝胶电泳的检测结果具有很好的一致性。结论 RPA技术结合NAH-LFS具有特异性强、灵敏度高、操作简单的优点,可实现牛肉中鸡、鸭、猪源性成分的同时可视化快速检测。 展开更多
关键词 肉类鉴定 双拖尾重组聚合 核酸杂交 可视化检测
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猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增快速诊断方法的建立和应用 被引量:6
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作者 张森豪 王雪莹 +12 位作者 蔡李萌 解伟纯 匡虹迪 王晓娜 李佳璇 崔文 姜艳平 周晗 单智夫 王丽 乔薪瑗 李一经 唐丽杰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期2498-2508,共11页
旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶... 旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶扩增的引物,优化了重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)反应体系,检测了反应的特异性和敏感性,确定了反应的最佳温度和时间,通过结合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的方法进行分析和鉴定。试验结果显示反应的最佳温度和时间为30℃、20 min,反应可以检测到的最低质粒拷贝数为102 copies·μL^(-1),且在对猪的丁型冠状病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和圆环病毒2型的检测中具有良好的特异性。综上所述,通过对RPA反应条件的摸索与优化,成功建立了猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合琼脂糖凝胶电泳(Basic RPA)和侧流层析试纸条(LF-RPA)的检测方法,两种方法相比较于RT-PCR,有更短的检测时间且具有更高的敏感性,对仪器、场地和检测环境的要求更低,为今后PEDV的临床诊断及快速检测提供了更多的选择和更有效的技术支持。 展开更多
关键词 行性腹泻病毒 重组聚合(RPA) 层析(LFD) 快速诊断方法
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重组酶等温扩增试纸条快速检测阪崎克罗诺杆菌 被引量:11
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作者 陈纯阳 张宸宁 +2 位作者 史爱莹 杜欣军 王硕 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第24期306-312,共7页
将重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与免疫层析试纸条(lateral flowstrip,LF)相结合,建立一种阪崎克罗诺杆菌快速检测方法(RPA-LF)。将引物分别用生物素和地高辛修饰后进行RPA,产生生物素和地高辛标记... 将重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与免疫层析试纸条(lateral flowstrip,LF)相结合,建立一种阪崎克罗诺杆菌快速检测方法(RPA-LF)。将引物分别用生物素和地高辛修饰后进行RPA,产生生物素和地高辛标记的双链DNA产物,扩增产物与胶体金标记的地高辛抗体及试纸条上固定的链霉亲和素发生特异性结合,最终在试纸条上呈现肉眼可见的结果。灵敏度分析结果显示,该方法对纯培养目标菌的检测限为1.7×102 CFU/mL,特异性分析结果显示RPA-LF方法与其他常见病原菌无交叉反应。利用人工污染的食物样品评估RPA-LF检测效果,结果显示不同样品增菌4 h或6 h后,检测限达到1.7×100 CFU/g。利用20 种实际样品作为检测对象、利用国标方法作为对照,评估方法的检测效果,结果显示本研究所建立的方法与国家标准检测方法获得一致的检测结果。 展开更多
关键词 重组聚合等温技术 免疫层析试纸 阪崎克罗诺杆菌 快速检测
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杀鲑气单胞菌可视化重组酶聚合酶扩增检测技术的建立 被引量:1
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作者 谷庆花 李铭远 +1 位作者 司鑫鑫 高嵩 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2022年第1期52-57,共6页
本研究根据杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的铁载受体(fstA)基因的保守序列设计特异性引物和探针,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与侧向流试纸条(lateral flow strips,LFS)相结合的... 本研究根据杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的铁载受体(fstA)基因的保守序列设计特异性引物和探针,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与侧向流试纸条(lateral flow strips,LFS)相结合的可视化快速检测杀鲑气单胞菌的方法。结果显示:本研究建立的基于RPA-LFS的杀鲑气单胞菌检测方法在37℃孵育25 min即可完成,特异性良好,与其他致病菌无交叉反应;灵敏度实验结果显示,该菌的纯培养物和人工污染的鲤鱼组织中的最低检测限均为单次反应1 CFU(colony forming unit)。本研究建立的基于RPA-LFS的杀鲑气单胞菌检测方法具有特异、灵敏、快速等优点,检测结果可通过肉眼直接观察,操作简单,不依赖昂贵的仪器设备,适用于养殖业中杀鲑气单胞菌的现场检测。 展开更多
关键词 杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida) 重组聚合 试纸 现场检测
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牛病毒性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)快速诊断方法的建立与应用 被引量:6
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作者 杨森 王倩颖 +5 位作者 刘可欣 王超 谭斌 刘俊峰 胡建军 张淑琴 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期685-690,共6页
本研究开发了一种基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术结合侧流层析试纸条(LFD)快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法。该方法根据5′-UTR保守序列设计nfo RPA特异性引物和探针,35℃孵育25 min即可完成对BVDV核酸的识别与扩增,室温条件下仅... 本研究开发了一种基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术结合侧流层析试纸条(LFD)快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法。该方法根据5′-UTR保守序列设计nfo RPA特异性引物和探针,35℃孵育25 min即可完成对BVDV核酸的识别与扩增,室温条件下仅需5 min便可肉眼在试纸条上观察到结果。结果显示,该方法最低检测限为60 copies/μL,且仅能够检测出BVDV1型和2型,与猪瘟病毒(CSFV)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)等其他病毒无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。对临床样本的检测结果表明,该方法的测定性能与RT-qPCR一致,且RPA-LFD操作更加快速便捷,更适合现场环境中使用。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 重组聚合 层析 快速诊断方法
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猪嵴病毒重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)快速诊断方法的建立与应用 被引量:5
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作者 蔡应奎 刘新生 +2 位作者 张丽萍 周鹏 王永录 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期820-824,共5页
自2007年在猪粪便中首次检测到猪嵴病毒(PKV)以来,该病毒已在世界范围内被广泛报道,并可能与仔猪的腹泻有关。本研究首次建立了以重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)的技术来检测PKV的快速、可视化的诊断方法,并对此方法的敏... 自2007年在猪粪便中首次检测到猪嵴病毒(PKV)以来,该病毒已在世界范围内被广泛报道,并可能与仔猪的腹泻有关。本研究首次建立了以重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)的技术来检测PKV的快速、可视化的诊断方法,并对此方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果显示,该方法具有良好的特异性,仅可以特异性扩增PKV,与其它主要猪病毒没有交叉反应;最佳反应时间和温度是RPA在37℃下20 min及LFD在室温下10 min;检测极限为1×10~2拷贝的PKV。利用本研究建立的RPA-LFD方法和常规RT-PCR方法同时检测20份猪的临床粪便样品,结果显示,RPA-LFD方法检测猪嵴病毒阳性率为60%,明显高于常规RT-PCR的50%。上述结果表明,RPA-LFD方法可应用于猪嵴病毒的快速检测。 展开更多
关键词 猪嵴病毒 重组聚合(RPA) 层析(LFD) 快速诊断方法
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基于重组酶聚合酶扩增结合侧向流试纸条快速检测H7亚型禽流感病毒的方法研究 被引量:2
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作者 李翔 方斌 +2 位作者 余晓 叶国军 刘琳琳 《国际病毒学杂志》 2020年第6期497-500,共4页
目的建立一种快速、灵敏、可视化的H7亚型禽流感病毒等温核酸扩增检测方法。方法针对H7N9禽流感病毒的HA片段保守区序列设计引物、探针,优化反应温度,建立H7亚型禽流感病毒的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条检测技术,评价其特异性... 目的建立一种快速、灵敏、可视化的H7亚型禽流感病毒等温核酸扩增检测方法。方法针对H7N9禽流感病毒的HA片段保守区序列设计引物、探针,优化反应温度,建立H7亚型禽流感病毒的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条检测技术,评价其特异性和敏感性,并与Real time PCR方法进行比较。结果该方法检测H7亚型禽流感病毒的最低检出限为20拷贝/μL,与其他流感/禽流感病毒无交叉反应,反应可在20~50℃温度范围内进行,临床样本检测结果与Real time PCR法一致性为100.0%。结论该检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为在基层和现场快速检测H7亚型禽流感病毒提供了新的方法。 展开更多
关键词 H7亚型禽感病毒 重组聚合 试纸 快速检测
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基于重组酶聚合酶扩增结合侧流层析技术的B、E型腺病毒快速可视化检测方法的研究与评价 被引量:8
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作者 孙魁 邢微微 +1 位作者 徐东刚 宋伦 《军事医学》 CSCD 北大核心 2017年第7期547-551,共5页
目的建立一种快速、准确、可视化、易开展的B、E型腺病毒检测技术。方法针对B、E型腺病毒壳蛋白保守序列设计通用引物,建立可同时检测出这两种腺病毒型别的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification co... 目的建立一种快速、准确、可视化、易开展的B、E型腺病毒检测技术。方法针对B、E型腺病毒壳蛋白保守序列设计通用引物,建立可同时检测出这两种腺病毒型别的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测技术,评价其灵敏度与特异性,并验证最佳反应温度与反应时间,同时利用该法对19例B、E型腺病毒感染患者及10例健康志愿者鼻咽拭子标本进行检测。结果腺病毒LFD-RPA法检测灵敏度可达10拷贝/μl,与q PCR方法相近,且不会与其他亚属腺病毒及其他病毒发生交叉反应。反应可在25~45℃温度范围内高效进行,检测全程仅需15~20 min。利用临床咽拭子标本对检测体系进行评估,其灵敏度及特异性均达100%。结论该检测方法灵敏度高、特异性强、操作简单,反应快速,能脱离对大型仪器、专业操作人员及正规实验室的依赖,在基层卫生部门,尤其在野外及现场检测中具有极大的应用潜力。 展开更多
关键词 腺病毒科 重组聚合技术 层析试纸 可视化诊断
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李矮缩病毒重组酶聚合酶扩增—侧流层析试纸条检测方法的建立 被引量:5
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作者 陈玲 闫国华 +5 位作者 张晓明 周宇 王晶 段续伟 李彦林 张开春 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期183-192,共10页
根据李矮缩病毒(prunedwarfvirus,PDV)外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针,建立了PDV的重组酶聚合酶扩增—侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification combined with lateral flow dipstick,RPA-LFD)检测方法。... 根据李矮缩病毒(prunedwarfvirus,PDV)外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针,建立了PDV的重组酶聚合酶扩增—侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification combined with lateral flow dipstick,RPA-LFD)检测方法。该方法在恒温39℃下反应20 min,具有标记的扩增子可达到检测水平。扩增子检测室(amplicon detection champer)中的侧流层析试纸条在20 min内呈现可视化检测结果。该方法与侵染樱桃的另外6种病毒(CGRMV、PNRSV、Lch V-1、PBNSPa V、CVA和CNRMV)无交叉反应。灵敏度试验表明,用RPA-LFD方法检测PDV的灵敏性是PCR方法的10倍。用该方法检测13个田间样品,其检测结果与PCR检测结果一致。RPA-LFD法具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强等特点,适合对PDV样品的快速检测与鉴定。 展开更多
关键词 李矮缩病毒 樱桃 重组聚合层析试纸 检测
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侧流层析–重组酶聚合酶扩增技术快速检测土拉弗朗西斯菌 被引量:7
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作者 彭遥 阚飙 +4 位作者 夏连续 李伟 张雯 秦爱平 卢金星 《疾病监测》 CAS 2019年第5期455-459,共5页
目的利用侧流层析–重组酶聚合酶扩增(LF-RPA)技术建立快速、敏感、特异的土拉弗朗西斯菌(土拉菌)检测方法。方法基于土拉菌特异性基因(tul4)设计重组聚合酶恒温扩增方法的引物及探针,优化反应时间和温度,同时评价该方法的灵敏度及特异... 目的利用侧流层析–重组酶聚合酶扩增(LF-RPA)技术建立快速、敏感、特异的土拉弗朗西斯菌(土拉菌)检测方法。方法基于土拉菌特异性基因(tul4)设计重组聚合酶恒温扩增方法的引物及探针,优化反应时间和温度,同时评价该方法的灵敏度及特异性,并通过模拟血液样品评估此方法的实用性。结果该方法最佳反应条件是40℃,20 min,可检测核酸浓度最低为20fg/μl,与实时荧光定量PCR(qPCR)方法相近,且不与7种非土拉菌发生交叉反应。土拉菌模拟样本最低检测浓度为460CFU/ml。结论该检测方法操作简单,特异性良好,敏感度高且无需大型精密实验设备,在临床及现场检测土拉菌中具有应用前景。 展开更多
关键词 土拉弗朗西斯菌 重组 重组聚合 层析
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基于EuNPs的荧光侧流免疫层析联合双重RPA检测HPV16和HPV18的价值
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作者 王文文 马骉 +1 位作者 厉佳丽 许健 《浙江临床医学》 2022年第7期962-965,共4页
目的探讨重组酶聚合酶扩增(RPA)联合铕纳米粒子标记的荧光侧流免疫层析试纸条(EuNPs-LFIC)检测HPV16和HPV18的价值.方法根据HPV16和HPV18基因保守区域(L1),采用Primer5软件设计特异性引物和探针.采用荧光读数仪扫描EuNPs试纸条,对RPA扩... 目的探讨重组酶聚合酶扩增(RPA)联合铕纳米粒子标记的荧光侧流免疫层析试纸条(EuNPs-LFIC)检测HPV16和HPV18的价值.方法根据HPV16和HPV18基因保守区域(L1),采用Primer5软件设计特异性引物和探针.采用荧光读数仪扫描EuNPs试纸条,对RPA扩增产物定量分析.评估EuNPs-LFIC-RPA方法的敏感度和特异性,并与qPCR检测结果对比,计算实际临床样本检出符合率.结果在37℃等温条件下,RPA反应可在10min内完成.通过读取试纸条的荧光信号强度获得定量结果.EuNPs-LFIC-RPA方法可进行病毒单拷贝基因检测,并未观察到与HPV其他亚型的交叉反应.检测临床样本248份,与PCR-反向点杂交法的一致性分别为98.38%(κ=0.92,HPV16)、97.58%(κ=0.88,HPV18)和98.79%(κ=0.96,HPV16/18),EuNPs-LFIC-RPA同时检测HPV16和HPV18的敏感度和特异性分别是94.12%和100.00%.结论建立EuNPs-LFIC-RPA方法可满足宫颈细胞样本快速筛查的要求,为高危型HPV病毒临床检测提供新方法. 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒 铕纳米粒子 荧光免疫层析 重组聚合 双重检测
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迟缓爱德华氏菌等温扩增快速检测方法的建立 被引量:1
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作者 廖磊 马超 +1 位作者 高嵩 吉敬 《江苏海洋大学学报(自然科学版)》 CAS 2021年第4期35-41,共7页
迟缓爱德华氏菌是一种危害淡水及海水水产动物的致病菌,可感染包括鳗鲡、牙鲆、罗非鱼、鲤鱼等在内的多种水产鱼类,极易给水产养殖业造成严重的经济损失。现有的迟缓爱德华氏菌检测方法须借助实验室条件才能完成,检测过程较为复杂。建... 迟缓爱德华氏菌是一种危害淡水及海水水产动物的致病菌,可感染包括鳗鲡、牙鲆、罗非鱼、鲤鱼等在内的多种水产鱼类,极易给水产养殖业造成严重的经济损失。现有的迟缓爱德华氏菌检测方法须借助实验室条件才能完成,检测过程较为复杂。建立一种简便的、无需依赖实验室条件即可快速检测迟缓爱德华氏菌的方法,对水产养殖业预警和该病菌引发病害的防治具有重要指导意义和实用价值。针对迟缓爱德华氏菌的基因组设计了特异性引物和探针,建立了重组酶聚合酶扩增与侧向流试纸条(RPA-LFS)相结合的检测方法,评价了该方法的特异性和灵敏度,并使用人工模拟样本进行了方法验证。结果显示,RPA-LFS法在37℃孵育20 min即可完成核酸扩增步骤,整体检测时间不超过40 min,与参试的嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、灿烂弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌这8种水产和食品中常见的致病菌不发生交叉反应,对迟缓爱德华氏菌培养物的检测限为单次反应1个菌落形成单位(CFU),在富集培养后,可检出1×10^(1) CFU/g人工污染样本中的迟缓爱德华氏菌。该方法具有良好的特异性和灵敏度,不依赖精密仪器,是一种快速、便捷的迟缓爱德华氏菌检测方法,具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 迟缓爱德华氏菌 重组聚合 试纸 快速检测
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基于重组酶聚合酶扩增的曼氏血吸虫核酸可视化检测技术的建立及初步评价 被引量:3
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作者 王丽萍 吕超 +2 位作者 秦志强 许静 邓王平 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CSCD 北大核心 2022年第3期337-343,共7页
目的 结合重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和侧流层析试纸条(LFD),建立一种快速、便捷的曼氏血吸虫核酸可视化检测方法,并初步评价其检测效能。方法 以曼氏血吸虫细胞色素c氧化酶亚基1(SmCOX1)基因为靶序列,利用Primer Primer 5软件结合手工... 目的 结合重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和侧流层析试纸条(LFD),建立一种快速、便捷的曼氏血吸虫核酸可视化检测方法,并初步评价其检测效能。方法 以曼氏血吸虫细胞色素c氧化酶亚基1(SmCOX1)基因为靶序列,利用Primer Primer 5软件结合手工辅助,设计特异性引物和探针并进行筛选,建立曼氏血吸虫核酸LFD-RPA检测方法。制备不同浓度(1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl、0.1 fg/μl)的曼氏血吸虫成虫基因组DNA和含有不同拷贝数浓度(10^(5)、10^(4)、10^(3)、10^(2)、10^(1)、10^(0)、10^(-1)拷贝/μl)的SmCox1重组质粒DNA,评价所建立方法的敏感度。以曼氏血吸虫成虫、日本血吸虫成虫、埃及血吸虫虫卵、感染曼氏血吸虫双脐螺(阳性双脐螺)和阴性双脐螺、感染日本血吸虫钉螺(阳性钉螺)和阴性钉螺、华支睾吸虫成虫、大片形吸虫成虫、卫氏并殖吸虫成虫基因组DNA为模板,评价所建立方法的特异性。将30只雌性BALB/c小鼠随机分为40尾感染组、80尾感染组和健康对照组,每组10只,建立感染小鼠模型,提取感染后1~8周的小鼠粪样和血样DNA,评价LFD-RPA方法检测曼氏血吸虫早期感染的效能。结果 以SmCox1基因片段为靶标建立的曼氏血吸虫LFD-RPA检测方法以39℃、20 min为最佳反应温度和时间。敏感度检测结果显示,SmCox1-LFD-RPA方法对曼氏血吸虫成虫基因组、SmCox1重组质粒的检出限分别为10 fg/μl和10拷贝/μl。特异性检测结果显示,SmCox1-LFD-RPA方法仅对曼氏血吸虫和阳性双脐螺DNA特异,与其他吸虫DNA无交叉反应。SmCox1-LFD-RPA方法对感染小鼠1~8周血样及粪样DNA的检测结果显示,40尾组小鼠自感染后3周开始出现阳性条带,80尾组小鼠自感染后1周开始出现阳性条带,且条带颜色随感染时间延长逐渐加深。结论 建立了曼氏血吸虫LFD-RPA检测方法,其检出限低、特异性强,操作简单快捷。 展开更多
关键词 曼氏血吸虫 重组聚合 等温 可视化 试纸
原文传递
动物A型流感病毒RPA-LFD可视化检测方法的建立 被引量:4
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作者 刘文俊 阳佑天 +5 位作者 易华东 邓汝森 杨培洁 付新亮 黄运茂 田允波 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期474-478,共5页
为建立动物A型流感病毒(IV)的重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对A型IV基质蛋白(M)基因保守序列设计了引物和探针,通过反应条件优化,建立了RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法检测动物A型IV呈阳性,... 为建立动物A型流感病毒(IV)的重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对A型IV基质蛋白(M)基因保守序列设计了引物和探针,通过反应条件优化,建立了RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法检测动物A型IV呈阳性,与新城疫病毒、鸭坦布苏病毒、鸭肝炎病毒、小鹅瘟病毒等无交叉反应,特异性强;反应时间短、敏感性高,可以在35℃,20 min内检测到最低浓度为10拷贝/μL的重组质粒标准品。利用该方法对从化某活禽市场分离的鸭咽拭子样品共50份进行检测,结果3份为阳性,其余均为阴性,与PCR及病毒分离结果一致,准确性高。本研究首次建立了检测动物A型IV的可视化RPA-LFD检测方法,该方法不依赖任何仪器设备,操作简单、快速,可为基层实验室临床快速检测和流行病学研究提供帮助。 展开更多
关键词 重组聚合 层析试纸 A型感病毒
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快速检测十足目虹彩病毒1 RPA-LFD方法的建立及初步应用 被引量:1
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作者 袁雪梅 陈静 +5 位作者 黄雷 蔺凌云 潘晓艺 彭先启 焦锦彪 姚嘉赟 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期505-510,共6页
为建立一种高效、快速、简便的十足目虹彩病毒1(DIV1)检测方法,本研究以DIV1 ATPase基因为检测靶标,设计特异性引物和探针,采用方阵法优化反应温度和时间,结果显示,重组酶聚合酶扩增技术(RPA)最优反应温度为37℃,时间为15 min,结果观察... 为建立一种高效、快速、简便的十足目虹彩病毒1(DIV1)检测方法,本研究以DIV1 ATPase基因为检测靶标,设计特异性引物和探针,采用方阵法优化反应温度和时间,结果显示,重组酶聚合酶扩增技术(RPA)最优反应温度为37℃,时间为15 min,结果观察时间为5 min,检测过程总时长为20 min,初步建立了DIV1的重组酶聚合酶扩增技术结合侧向流试纸条方法(RPA-LFD)。提取其他7种常见虾类病原基因组与DIV1基因组,采用该方法检测,分析其特异性;构建重组质粒标准品p UC57-DIV1,10倍倍比稀释后采用该方法检测,分析其灵敏性;以3种不同浓度的重组质粒标准品为模板进行批间、批内重复性试验。结果显示,该方法能特异性检测DIV1,与虾类其他常见易感病原均无交叉反应;其对重组质粒标准品的检测限为1×10^(1)拷贝/μL;批内和批间重复性试验的检测结果均一致,重复性好。利用该方法与已发表的荧光定量PCR(qPCR)同时检测15份感染DIV1的罗氏沼虾样品及40份临床样品,结果显示,该方法的阳性检测率为69.09%(38/55),阴性率为30.91%(17/55),与q PCR检测结果一致,二者的阳性符合率、阴性符合率、总符合率均为100%。综上所述,本研究建立的RPA-LFD方法检测DIV1具有快速、简便、灵敏度高且特异性强的特点,且不需要精密昂贵的仪器设备,为基层实验室及现场检测提供了可行技术手段。 展开更多
关键词 重组聚合 试纸技术 十足目虹彩病毒I
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