IPTG诱导浓度对重组人肝再生增强因子基因表达的影响

以人肝再生增强因子(humanaugmenterofliverregeneration,hALR)基因与含有T7启动子的融合表达载体pET28a(+)相连的重组子(pET-A)作为研究对象,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG作为诱导剂,分析比较不同IPTG诱导浓度对于表达产物的影响,以确定最佳的IPTG诱导浓度。结果表明,当IPTG终浓度为1.0mmol·L-1时,hALR表达量最大。这为IPTG作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物的工业化生产提供了可靠的实验依据。

重组人肝再生增强因子对肝纤维化大鼠基质分解素-1基因表达的影响

为了解重组人肝再生增强因子 (hALR)对肝纤维化大鼠基质分解素 1(MMP3 )基因表达的影响 ,建立CCl4 中毒性及人血白蛋白免疫损伤性两种大鼠肝纤维化模型 ,模型完成后予不同剂量hALR治疗 ,在不同的时间点留取大鼠肝组织标本 ,提取总RNA ,用逆转录定量聚合酶链反应 (RT PCR)测定MMP3 的基因表达水平。结果在两种模型中hALR治疗组大鼠肝组织MMP3 的基因表达水平在治疗过程中的不同阶段均明显高于模型组 ;高剂量hALR组大鼠肝组织基质分解素 1的基因表达水平均明显高于低剂量组。提示hALR可增强肝纤维化大鼠MMP3

重组人肝再生增强因子可抑制肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的基因表达

在培养的肝星状细胞系中加入不同浓度的重组人肝再生增强因子 (hALR) ,于不同的时间点收集细胞 ,提取总RNA ,用逆转录定量PCR方法测定Ⅰ、Ⅲ型胶原的基因表达水平。结果表明 ,高 ( 0 2ng/L)、中( 0 0 2ng/L)、低 ( 0 0 0 2ng/L)浓度的hALR 3组肝星状细胞Ⅰ型胶原基因表达水平在 8、2 4、48、72h 4个时间点均明显低于对照组 ;大剂量组较中、低剂量组Ⅰ型胶原基因表达水平亦明显为低。中、低剂量hALR组肝星状细胞Ⅲ型胶原基因表达水平在 2 4、48、72h 3个时间点明显低于对照组 ;大剂量hALR组肝星状细胞Ⅲ型胶原基因表达水平在 8、2 4、48、72h 4个时间点均明显低于对照组 ,较中、小剂量组亦显著降低。提示重组人肝再生增强因子对肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达有明显的抑制作用。

重组人肝再生增强因子基因转染肝细胞系的增殖活性研究

目的研究重组人肝再生增强因子(hALR)转染肝细胞系的生物学活性,为生物人工肝细胞反应器提供合适的细胞材料。方法本研究采用转染重组质粒pcDNA3.1(-)hALR的HepG2细胞,经G418筛选,在体外培养、传代后,进行Western blot免疫印迹实验及免疫荧光实验,检测细胞中hALR的表达,并与未转染重组质粒的HepG2细胞进行比较;采用ELISA方法,检测两组细胞培养液中hALR的分泌情况;使用流式细胞仪检测细胞中增殖细胞相关核抗原Ki-67,了解重组质粒转染前后HepG2细胞的增殖状况。结果转染重组质粒pcDNA3.1(-)hALR的HepG2细胞功能稳定,形态良好,细胞表达及分泌hALR较未转染重组质粒的HepG2细胞多,且随着培养时间的延长,细胞培养液中的hALR含量迅速升高,优于未转染重组质粒的HepG2细胞;转染重组质粒的HepG2细胞中Ki-67阳性细胞计数显著高于未转染重组质粒的HepG2细胞,说明转染重组质粒使肝细胞增殖活跃。结论本研究结果表明,前期研究构建的转染了hALR基因的肝细胞系能较高表达hALR,且细胞增殖活跃。

人肝再生增强因子基因序列的优化、重组表达及功能研究

目的:体外重组表达人肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)并进行功能研究。方法:全基因合成ALR序列并插入原核表达载体pET28a+,转化入BL21菌内进行诱导表达,表达产物经过纯化后利用MTT法观察表达产物对人肝细胞的刺激增殖活性;利用小鼠急性四氯化碳损伤模型观察表达产物的肝功能保护作用。结果:酶切鉴定及测序结果提示表达产物正确;纯化后表达产物具有明确的促进肝细胞增殖作用,并在中、低剂量具有降低小鼠急性化学性损伤后转氨酶水平的作用。结论:重组表达的ALR结构正确,具有促进肝细胞再生的作用。

重组大鼠再生增强因子救治急性肝衰竭的实验研究

肝再生增强因子是一种新的肝细胞增殖刺激因子。在本实验利用我们自行表达的重组大鼠肝再生增强因子，观察了其对四氯化碳诱导的急性肝功能衰竭大鼠的救治作用。初步结果表明：重组肝再生增强因子能够显著提高中毒大鼠的存活率，降低中毒大鼠外周血ＡＬＴ，ＡＳＴ的水平。提示重组肝再生增强因子可能应用临床治疗严重肝病。

重组人肝再生增强因子在体外能刺激HTC肝癌细胞DNA合成

在成功克隆人肝再生增强因子（hALR）CDNA的基础上，本研究将人ALR编码区cDNA亚克隆于真核瞬间表达质粒pCDNAⅠ，构建了真核表达质粒pCDNAⅠ－hALR，转染cos-7细胞后，表达产物生物活性检测表明：真核表达的hALR在体外能刺激HTC肝癌细胞增殖，这一体外活性的确定为重组人ALR的纯化提供了简洁、可靠的检测方法。

重组人肝再生增强因子可预防免疫损伤性肝纤维化的形成

观察重组人肝再生增强因子（ｒｈＡＬＲ）对免疫损伤性肝纤维化的预防作用。建立人血白蛋白免疫损伤性大鼠肝纤维化模型。在造模的同时予ｒｈＡＬＲ腹腔注射。观察大鼠存活率，血清ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＬＤＨ水平，肝组织胶原蛋白含量及肝脏病理学改变。结果：ｒｈＡＬＲ可提高人血白蛋白免疫损伤性肝纤维化大鼠存活率；降低肝纤维化大鼠的ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＬＤＨ水平；病理检查显示ｒｈＡＬＲ有明显减轻大鼠肝纤维化形成的作用；肝组织胶原蛋白含量的测定也表明ｒｈＡＬＲ预防组大鼠肝组织胶原蛋白含量明显低于模型组及阴性对照组。结论：重组人肝再生增强因子可预防免疫损伤性肝纤维化的形成。

大鼠肝再生增强因子基因组DNA的克隆化与序列分析

根据大鼠肝再生增强因子 (Augmenterofliverregeneration ,ALR)cDNA序列设计特异性引物 ,采用多聚酶链反应 (PCR)法自Wistar大鼠基因组DNA中扩增出大鼠ALR基因组DNA ,全长为 15 0 8nbp ,结构为 3个外显子和 2个内含子 ,外显子长度分别为 18bp、197bp和 16 3bp ,各编码 6个、6 4个和 5 5个氨基酸残基 ,长度与小鼠、人类ALR的外显子一致。

不同剂量不同载体不同途径的肝再生增强因子重组质粒抗大鼠肝纤维化疗效比较

目的筛选肝再生增强因子重组质粒基因治疗时较优的载体、途径和剂量及三者的最佳组合。方法制备肝纤维化大鼠模型,L9(33)正交设计分组,用3种不同的载体(裸基因、脂质体、多聚物)携带不同量(50、100、200μg/kg)的肝再生增强因子重组质粒,采用3种给药途径(肌肉注射、静脉注射、腹腔注射)对模型大鼠进行干预,通过肝组织病理学、肝纤4项等指标来判断疗效并进行对照。结果剂量因素:200μg/kg组纤维化半定量计分和肝纤4项综合得分明显低于50μg/kg组和100μg/kg组,但50μg/kg组和100μg/kg组的结果无显著性差异。载体因素:裸基因组、脂质体组和多聚赖氨酸组3组之间的纤维化半定量计分均无显著性差异。脂质体组和多聚赖氨酸组的肝纤4项综合得分均明显低于裸基因组。途径因素:肌肉注射组、静脉注射组和腹腔注射组3组之间的纤维化半定量计分均无显著性差异。腹腔注射组的肝纤4项综合得分明显高于肌肉注射组和静脉注射组。结论200μg/kg的肝再生增强因子重组质粒的抗大鼠免疫性肝纤维化的疗效优于100μg/kg和50μg/kg;由脂质体携带DNA和由多聚物携带DNA的疗效明显优于裸DNA。肌肉注射和静脉注射的疗效明显优于腹腔注射。由脂质体或多聚物携带、静脉或肌肉注射200μg/kg的肝再生增强因子重组质粒,能取得较好的抗大鼠免疫性肝纤维化的疗效。

肝再生增强因子重组质粒对肝纤维化大鼠的实验治疗作用

目的 研究肝再生增强因子真核表达质粒对免疫性肝纤维化大鼠的治疗作用并探讨其分子机制。方法 制作猪血清诱导的免疫性肝纤维化大鼠模型,将成模大鼠随机分成模型组、秋水仙碱治疗组(Col)、ALR治疗1组(ALR1 )、ALR治疗2组(ALR2 ) ,分别给予生理盐水、秋水仙碱、pcDNA3 ALR重组质粒治疗。用药4周后处死大鼠,留取血标本和组织标本,免疫组织化学测定Ⅰ、Ⅲ型胶原、TIMP 1和ALR在肝组织的表达,RT PCR测定TIMP 1mRNA的表达。结果 两个ALR治疗组的肝纤维化分级明显改善。免疫组化结果显示,Ⅰ、Ⅲ型胶原和TIMP 1在肝组织的表达在两个ALR治疗组明显低于模型组,而ALR的表达要明显强于模型组。TIMP 1mRNA在两个ALR治疗组肝组织中的表达明显低于模型组。结论 ALR重组质粒对免疫性肝纤维化大鼠有改善作用,并可能通过抑制TIMP 1活性表达而促进肝细胞外基质降解。

微囊化和基因修饰的肝细胞移植——人肝再生增强因子(hALR)的原核表达、纯化及生物活性研究

目的 :构建人肝再生增强因子原核融合表达载体 ,并对表达产物进行生物活性研究 ,从而为hALR基因修饰的肝细胞移植的细胞来源研究提供实验依据 ,并为人肝再生增强因子的临床应用奠定基础。方法 :以pGEM -T -hALR为模板 ,应用PCR技术扩增出hALRcDNA ,克隆入原核融合表达载体pGEX - 4T - 2 ,限制性内切酶酶切及测序证实序列正确 ;转化大肠杆菌JM10 9:挑取阳性克隆以IPTG诱导表达融合蛋白GST -hALR ,融合蛋白通过谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析纯化后进行凝血酶酶切获得hALR单体 ;采用3 H -thymidine渗入法检测hALR单体的生物学活性。结果 :以 pGEM -T -hALR为模板 ,行PCR扩增后 ,产物于1.5 %琼脂糖凝胶电泳分析 ,可见 380bp特异性条带 ,符合hALRcDNA阅读框架的大小。构建融合蛋白GST-hALR的重组表达质粒pGEX - 4T - 2 -hALR ,经限制性内切酶酶切分析 ,与理论值相符 ,测序证明序列正确 ,片段为正向插入。重组表达质粒转化人肠杆菌JM 10 9。SDS -PAGE电泳分析显示重组菌在约 4 1KD处出现一蛋白条带。纯化、酶切后融合蛋白前体谷胱甘肽S -转移酶约 2 6KD ,hALR约 15KD。薄层扫描蛋白电泳结果表明 ,表达的融合蛋白占细菌可溶性蛋白总量的 31%。纯化hALR加入原代鼠肝细胞、HepG2 细胞培基 。

重组人肝再生增强因子对小鼠CCl_4中毒性肝损伤的治疗作用

目的:利用大肠杆菌的基因工程技术,制备重组的人肝再生增强因子(ALR)药物,对于CCl4肝损伤的小鼠模型进行治疗, 评价重组的人肝再生增强因子在肝损伤治疗中的效果和价值. 方法:应用大肠杆菌系统,表达、纯化重组人肝再生增强因子蛋白.利用四氯化碳法制备肝细胞损伤的动物模型,以重组的人肝再生增强因子药物进行治疗,以生理盐水治疗作为对照,比较治疗后血清ALT,AST水平的变化,评价重组的人肝再生增强因子对于肝损伤的治疗作用. 结果:成功制备了重组的人肝再生增强因子药物,纯度在98%以上.成功制备了四氯化碳的小鼠肝损伤模型,经过重组的人肝再生增强因子药物治疗后,血清中ALT,AST水平都有显著的下降(ALT:991 U/L对2 134 U/L,P<0.01; AST:938 U/L对1873 U/L,P<0.01). 结论:重组的人肝再生增强因子药物,有希望成为各种原因引起的肝细胞损伤的治疗药物.

肝再生增强因子及其基因家族的研究进展

肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)是新发现的一个重要的肝营养性因子,具有独特的分子结构、复杂的生物学功能和作用机制,能够特异性地促进肝细胞再生,在肝脏发育、再生和损伤修复的调节中具有重要作用。其基因家族成员在从低级到高级真核细胞中均有着重要的生物学功能。本文就近年来对ALR及其基因家族的分子生物学特征,以及ALR蛋白的生物学功能和作用机制等方面的研究进展作一综述。

重组人肝再生增强因子对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体DNA的保护作用

目的:初步探讨重组人肝再生增强因子(rhALR)保护及改善梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体功能及肝功能的机制。方法:144只健康wistar大鼠随机分为SHAM组,BDO-RBF组,BDO-RBF-rhALR组,利用荧光定量PCR方法,对各组大鼠肝细胞总mtDNA、缺失型mtDNA进行相对定量检测结果:胆道梗阻后,肝细胞线粒体总mtDNA拷贝数出现明显下降(P<0.01),BDO-RBF-rhALR组总mtDNA拷贝数下降程度明显低于BDO-RBF组(P<0.05);对于缺失型mtDNA占总mtDNA的百分比,在SHAM组,未检测出缺失型mtDNA,而在BDO-RBF组及BDO-RBF-rhALR组,均可见缺失型mtDNA,BDO-RBF组的缺失型mtDNA占总mtD- NA的百分比明显高于BDO-RBF-rhALR组(P<0.05);在胆道梗阻解除后,BDO-RBF-rhALR组的总mtDNA的拷贝数及缺失型mtDNA修复速度明显快于BDO-RBF组(P<0.05)结论:rhALR可通过保护及修复梗阻性黄疸大鼠肝细胞受损的mtDNA,达到保护及改善梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体功能及肝功能的目的。

腹腔注射重组人肝再生增强因子促进梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体转录因子A及核呼吸因子1的表达

目的:观察重组人肝再生增强因子(recombinant humanaugmenter of liver regeneration,rhALR)对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)及核呼吸因子1(nuclear respiratory factor-1,NRF-1)表达的影响。方法:健康Wistar大鼠随机分为假手术(Sham)组、胆道梗阻再通(BDO-RBF)组、胆道梗阻再通及rhALR治疗(BDO-RBF-rhALR)组(n=48),利用荧光定量PCR方法检测各组大鼠肝细胞TFAM、NRF-1mRNA的表达。结果:当胆道梗阻后,大鼠肝细胞TFAM、NRF-1mRNA表达均下降(P<0.05),且随着梗阻时间的延长其下降程度逐步增加;解除梗阻后,其拷贝数逐步恢复。BDO-RBF-rhALR组大鼠TFAM、NRF-1mRNA表达明显高于同一时间点BDO-RBF组(P<0.05)。结论:腹腔注射rhALR可能通过促进梗阻性黄疸大鼠肝细胞TFAM、NRF-1mRNA表达发挥保护肝功能的作用。

大鼠肝再生增强因子的基因克隆

目的克隆大鼠肝再生增强因子基因编码序列 ,并在原核细胞表达。方法按文献报道大鼠肝再生增强因子核苷酸序列合成引物 ,从 2周龄大鼠肝组织提取RNA ,利用RT PCR扩增大鼠肝再生增强因子基因编码区 ;将PCR扩增片段亚克隆到pBV2 2 1质粒 ,构建原核表达重组载体 ,导入到大肠杆菌后热诱导表达目的蛋白。结果从大鼠肝脏的RNA中扩增到长约 4 0 0bp的肝再生增强因子cDNA编码区基因 ,序列分析表明与文献报道一致 ;重组克隆经热诱导表达出分子量约 15kD大小的蛋白质 ,与预期值一致。结论从 2周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因 ,并获得了原核细胞高效表达。

人肝再生增强因子下调钙结合蛋白S100A11基因表达的研究

目的探讨人肝再生增强因子(ALR)对钙结合蛋白S100A11启动子(S100A11p)转录的调节作用。方法利用生物信息学技术确定S100A11p区域,聚合酶链反应(PCR)扩增S100A11p,克隆至真核报告载体pCAT3中,构建pCAT3S100A11p报告载体;以该质粒转染HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,并以人ALR的真核表达载体pcDNA3.1(-)ALR共转染的HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测CAT的表达活性。结果pCAT3S100A11p在HepG2细胞中具有CAT的表达活性;以pcDNA3.1(-)ALR和pCAT3S100A11p共转染HepG2细胞,CAT表达活性是单独转染细胞组pCAT3S100A11p的0.42倍。结论所克隆的S100A11启动子有启动子的转录活性,ALR的转基冈表达具有对S100A11基因的下调作用。

人肝再生增强因子上调细胞周期素B2基因的表达

目的研究人肝再生增强因子(ALR)转基因表达对细胞周期素B2启动子(cyclin B2p)转录的调节作用,从而进一步探讨ALR的生物学作用及机制。方法根据文献确定细胞周期素B2p区域,聚合酶链反应(PCR)扩增细胞周期素B2p,克隆至报告基因表达载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-cyclin B2p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,同时与ALR的真核表达载体pcDNA3．1(-)-ALR共转染HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果成功构建pCAT3- cyclin B2p报告基因表达载体;pCAT3-cyclin B2p与pcDNA3．1(-)-ALR共转染HepG2细胞系的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的25．13倍,是pCAT3-cyclin B2p单转染的2．60倍。结论人ALR对细胞周期素B2p基因的转录表达具有反式激活作用。