艰难梭状杆菌重组肠毒素A和B与对应天然肠毒素蛋白的功能活性比较

目的肠毒素A(TcdA)和肠毒素B(TcdB)是艰难芽孢梭状杆菌主要的毒力因子,我们对已经获得的纯化的重组蛋白TcdA和TcdB与对应的天然肠毒素蛋白的活性和功能进行了比较。方法通过光学显微镜观察重组肠毒素和对应的天然肠毒素对肠上皮细胞的细胞病变作用、蛋白印迹实验观察对Rac1蛋白的糖基化作用,以及激光共聚焦显微镜观察肠毒素对肠上皮细胞骨架的破坏作用。结果纯化得到重组蛋白肠毒素TcdA和rTcdB其分子量与天然的TcdA和TcdB蛋白大小接近,生物活性与天然的TcdB蛋白相似,TcdA和极微量TcdB具有使肠上皮细胞病变、Rac1蛋白的糖基、细胞骨架塌陷。结论艰难梭状芽孢杆菌肠毒素A和B重组蛋白具有良好的对应天然肠毒素相似的生物学功能活性。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因表达系统构建

从E .coli 4 4 815株基因组DNA中扩增不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因并分析了核苷酸序列 ,构建pET32a的LTB表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用SDS PAGE鉴定表达产物。克隆的LTB基因与报道的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 97.5 8%～ 99.19% ,pET32a LTB BL2 1DE3系统表达的rLTB量约占细菌总蛋白的 30 %。

重组金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白可溶性微针制备及免疫效果研究

目的建立重组金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)蛋白的可溶性微针体外检测方法及体内免疫效果评价。方法通过动态光散射(DLS)检测蛋白粒径、BCA法检测单片微针的蛋白浓度、活体成像实验检测微针皮内注射后蛋白在体内的停留时间,通过DRIZE评分评价微针注射后的皮肤情况,通过动物实验评价重组SEB蛋白可溶性微针的免疫原性及免疫保护效果。结果DLS分析显示SEB蛋白可溶性微针负载的重组SEB蛋白粒径与重组SEB蛋白溶液中的SEB蛋白粒径无明显差别,单片微针中重组SEB蛋白含量为(13.2±1.4)μg,活体成像实验显示相对于肌肉注射,重组SEB蛋白可溶性微针皮内给药后荧光蛋白在体内的停留时间延长,动物实验显示13.0μg的重组SEB蛋白可溶性微针即能引发免疫反应,并且在2LD50SEB攻毒剂量下能够产生很好保护效果。结论重组SEB蛋白可溶性微针能够刺激小鼠机体产生较好的免疫原性及免疫保护效果,为发展疫苗新型免疫途径提供了新策略。

抗仔猪腹泻重组复合多价疫苗的抗原制备及其条件优化

研究旨在探究重组复合多价抗腹泻疫苗主要抗原的制备工艺条件并进行优化。结果表明,采用优化后的提取和纯化方法能够有效提高疫苗抗原之一重组三价肠毒素的纯度和产率;使用改良Minca培养基能够使菌毛抗原产肠毒素大肠杆菌F4和F5菌毛蛋白表达量更高,等电点沉淀法可将菌毛蛋白纯度提至约100%。通过上述优化方法制备复合多价疫苗所需的重组肠毒素蛋白抗原和菌毛蛋白抗原纯度较高,可用于后期疫苗的制备。

重组金黄色葡萄球菌肠毒素A的表达及鉴定

目的通过基因重组方式获得高纯度、高含量重组金黄色葡萄球菌肠毒素A(rSEA)。方法将金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因片段插入pET28a载体中,测序并正确鉴定后,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达目的蛋白。重组蛋白用Ni-NTA His蛋白亲和柱纯化。结果 SDS-PAGE结果表明成功表达了分子量约为30 kD的重组蛋白,经Western blot和小鼠生物学鉴定,表达产物为重组金黄色葡萄球菌肠毒素A,并且具有较好的免疫原性,为制备抗金黄色葡萄球菌肠毒素A单克隆抗体及建立相应的免疫学检测方法奠定了基础。结论构建的rSEA表达载体稳定,可高效表达目的 rSEA蛋白。

重组LTB蛋白在水弧菌VSP60中的高效表达与纯化

目的 优化重组大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位 (rLTB)工程菌 (VSP6 0 )高效表达的条件。方法 以UVP凝胶照相系统扫描以及改良Lowry′s法检测rLTB表达量并分析各种因素对其影响。利用SephacrylS 10 0凝胶层析纯化rLTB蛋白。结果 工程菌 30℃振荡培养至吸光度 (A6 0 0 )值达0 .2～ 0 .3时加IPTG(终浓度为 0 .5mmol L) ,诱导培养 18～ 2 2h为rLTB蛋白表达的最佳条件。SephacrylS 10 0凝胶柱一步层析后 ,rLTB蛋白纯度可达 98.1%。结论 本研究所用的培养和纯化工艺简单易行 ,可获得高产量、高纯度的rLTB蛋白。

双蛋白载体A、C群脑膜炎球菌多糖结合物的免疫效果观察

目的 比较和评价在A、C群脑膜炎球菌多糖结合物中应用两种蛋白作为载体的免疫效果.方法 构建不耐热肠毒素B亚单位（LTB）的克隆载体和表达载体.确定rLTB主要为可溶性表达.应用一步阳离子交换层析对rLTB进行纯化,获得较纯的目的蛋白.利用GM1-ELISA和非变性SDS-PAGE的方法确定纯化后的rLTB能够形成具有生物学活性的五聚体.最后利用化学方法（ADH方法）将通过基因工程手段获得的重组LTB五聚体蛋白与C群脑膜炎球菌多糖（GCMP）耦联,获得多糖蛋白结合物GCMP-rLTB.以单一蛋白破伤风类毒素（TT）为载体的A＋C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物（GAMP-TT和GCMP-TT）及同时应用两种蛋白载体的A＋C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物（GAMP-TT和GCMP-rLTB）分别通过腹腔注射途径免疫小鼠.应用ELISA方法分别检测小鼠血清中IgG水平.结果 单独以TT为载体的A＋C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物（GAMP-TT和GC-MP-TT）和同时以两种蛋白作为载体的A＋C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物（GAMP-TT和GCMP-rLTB）通过注射途径免疫小鼠,后者产生的血清多糖特异性IgG水平显著高于前者.结论 双蛋白载体在改善A、C群脑膜炎球菌多糖结合物疫苗的免疫原性方面具有明显优势.