重组肠激酶在甲醇酵母中高效表达的培养条件研究

对重组肠激酶在甲醇酵母中高效表达的发酵条件进行了优化 ,并在 Bioflo 发酵罐中实现了高密度培养和高效表达 .结果表明 :温度 3 0℃ ,培养基 p H6.0 ,当酵母密度达到 2 0 0 A6 0 0 nm以上时 ,加入无水甲醇 ,控制甲醇的流加体积 ,使其终体积分数为 1 .0 %～ 3 .0 % ,继续诱导培养 72 h左右 ,酵母菌密度可达到 1 5 0 g/L,重组肠激酶总活性可达 5 8k

重组肠激酶在大肠杆菌中的发酵与纯化

对重组肠激酶在大肠杆菌中的高密度发酵表达条件、纯化方法及其生物活性测定进行了研究。结果表明:在E.coli表达系统中,控制温度为37℃,培养基pH 7.4,当A600为8.0时,加入0.3mmol/LIPTG进行诱导,温度降低至30℃,连续诱导3 h,蛋白表达量达25%。经SDS-PAGE测定,纯化的重组肠激酶纯度达80%以上,并能高效切开融合蛋白。

重组肠激酶催化亚基在毕氏酵母中的高密度发酵、纯化及活性鉴定

应用RT-PCR和搭桥PCR技术,扩增肠激酶催化亚基的cDNA,测序正确后克隆至酵母分泌型表达质粒p9K中.将重组质粒p9K/EKLC转化至表达宿主pichia pastoris GS115,筛选得到高效表达重组牛肠激酶催化亚基工程菌.经甲醇诱导,目标蛋白肠激酶催化亚基(EKLC)表达并分泌至酵母培养基中.高密度发酵后,经超滤浓缩,采用SP Sepharose F.F一步纯化得到纯度达98%以上的重组目的蛋白,活性达到2.3 U/uL.上述结果表明,本实验成功获得了肠激酶催化亚基,它是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.

重组牛肠激酶轻链基因在大肠杆菌中的表达与纯化

肠激酶(Enterokinase,EK,EC3.4.21.9)是一种以异源二聚体形式存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶,通过在位点(Asp)4-Lys的羧基端进行高效特异酶切,将胰蛋白酶原激活为胰蛋白酶。以GenBank公共数据库中牛肠激酶轻链基因序列(Acces-sion No.NM174439)设计引物,利用RT-PCR方法合成牛肠激酶轻链基因片段,并克隆进pET39b载体中DsbA片段的C’端,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得DsbA/牛肠激酶轻链融合蛋白。经镍离子螯合层析纯化,每升培养液中可得到2.7-3.0mg重组牛肠激酶。对含有肠激酶酶切位点的IL-11/MBP融合蛋白进行酶切,结果表明,酶解率可达到95%以上,为重组牛肠激酶的大规模生产打下了基础。

变性剂对重组牛肠激酶活性的影响

肠激酶(EK,EC 3.4.21.9)是一种在基因工程产品中广泛应用的工具酶.以小分子荧光物质Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-萘胺为底物,采用荧光跟踪法研究了变性剂盐酸胍、硫脲、尿素对重组牛肠激酶(rEK)活力的影响及抑制动力学.结果表明:盐酸胍、硫脲、尿素均对该酶的活性有较强的抑制作用,它们对该酶的半抑制浓度(IC50)分别为0.025,0.080和0.750 mol/L.研究的3种变性剂对该酶的抑制均显示可逆抑制机理;抑制类型也均为竞争性类型,测定它们对酶的抑制常数KI分别为0.015,0.060和0.553 mol/L.

重组牛肠激酶轻链基因在毕赤酵母中的表达与纯化

目的:构建重组牛肠激酶轻链的基因工程菌,并进行表达和纯化,以获得高纯度和高活性的重组牛肠激酶轻链蛋白。方法:以GenBank公共数据库中的牛肠激酶轻链基因序列(AccessionNo.NM174439)设计引物,利用RT-PCR合成牛肠激酶轻链基因片段,并克隆进pPIC9K载体,同时在基因N端插进6个组氨酸标签,转化毕赤酵母GS115,进行筛选和诱导表达。产物经镍离子螯和层析和Q-SepharoseFF柱纯化,并酶切融合蛋白检测其活性。结果:培养液中重组牛肠激酶轻链蛋白表达量为3.0mg/L。对含有肠激酶酶切位点的IL-11/MBP融合蛋白进行酶切,结果表明,酶解率可达到90%以上。结论:表达并获得了高纯度的重组肠激酶轻链蛋白,为大规模生产打下了基础。

牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的非融合表达及生物学活性分析

该研究尝试利用大肠杆菌表达体系以非融合蛋白形式表达牛肠激酶轻链(EK_(LC))。利用基因重组技术构建重组表达载体p6×His-D_4K-EK_(LC)并转化至E. coli DH5α,37℃过夜培养,超声破壁法释放菌体蛋白并收集包涵体,考察包涵体在不同浓度下的复性效率。复性后的目的蛋白经金属离子亲和层析纯化,并以EK_(LC)自切方式移除重组EK_(LC)的N-端6×His-D_4K序列得到具有天然N-端氨基酸序列的EK_(LC),酶活性测定结果显示该研究所制备的重组EK_(LC)高于商品化牛肠激酶。重组EK_(LC)在大肠杆菌中非融合表达成功,为实现EK_(LC)的经济、高效制备研究奠定了实验基础。