牛-兔种间重组胚体外发育能力的研究

以超排的青年母兔和经产母兔卵母细胞为受体细胞,以处于休眠期和非休眠期的黑毛和牛耳成纤维细胞为核供体,共获得180枚种间重组胚,采用M199+10%FBS和RD+10%FBS2种培养液进行体外培养,有112枚发育到2-细胞期(62.2%),26枚发育到桑椹胚期(14.4%),20枚发育到囊胚期(11.1%)。结果显示,供体细胞处于休眠期与否,对重组胚的卵裂率无显著影响(P<0.05),但以休眠期细胞为核供体的重组胚8-细胞～16-细胞胚的发育率及桑椹胚发育率显著高于非休眠期细胞的重组胚(P<0.05),二者在囊胚发育率上差异极显著(P<0.01);以M199为培养液的胚胎在卵裂率、桑椹胚发育率和囊胚发育率上与RD组无显著差异(P>0.05)。

谷氨酰胺对延边黄牛卵母细胞成熟及重组胚发育的影响

为了提高卵母细胞的成熟率及重组胚胎的发育率,在体外成熟液中添加了不同浓度的谷氨酰胺,研究谷氨酰胺对延边黄牛卵母细胞成熟的影响,并观察它对重组胚胎后续发育的影响,从中筛选出最佳的体外培养条件。结果表明,1.0 mmol/L的谷氨酰胺能够显著提高卵母细胞的成熟率,同时也能提高囊胚发育率。说明谷氨酰胺能够提高延边黄牛卵母细胞的体外成熟率,并能促进囊胚发育。

改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法,研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育.方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25 mm左右的小口,首先将第一极体挑出,再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞,去除包含有MⅡ期染色体-纺锤体复合体的最少量细胞质.随后,将直径为10～12 mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体.用电融合的方法诱导复合体融合,并对重组胚激活.体外培养72 h,对重组胚发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数.结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15 s;Hoechst 33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核:去核成功率为95.5%,注核成功率为76.7%,供体核-卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2%和62.2%;重组胚体外培养72 h内发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期的比率分别为57.5%、39.1%和27.6%;用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物,扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段,表明重组胚来源于供体卵丘细胞.结论应用改进的核移植方法,不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核,去核成功率高,而且操作简便,去核迅速,对卵母细胞损伤小,是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法.

谷氨酰胺对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚发育率，研究了在体外培养液中添加不同浓度的谷氨酰胺对克隆重组胚发育率的影响。试验中选择成熟培养20～22h的卵母细胞，脱颗粒细胞后选择排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核操作，然后将融合、激活后的卵母细胞在添加不同浓度谷氨酰胺的体外培养液中进行培养。结果显示，体外培养液中添加浓度为1．0mmol／L的谷氨酰胺能够显著提高延边黄体细胞克隆牛重组胚的发育率，表明在体外培养中添加谷氨酰胺能提高延边黄牛体细胞克隆效率。

共培养对延边黄牛重组胚体外发育的影响

以新鲜的颗粒细胞作为供核细胞,以延边黄牛MⅡ期去核的卵母细胞作为受体进行体外培养.使用CR1aa培养液培养时卵裂率(83.7%)显著高于TCM-199液和mSOF液组(76.9%和77.4%),但在重组胚的早期发育各阶段都不存在统计学差异(p>0.05).以CR1aa和TCM-199为基础液时,输卵管上皮细胞和颗粒细胞共培养在卵裂率及重组胚的各阶段发育率都有显著提高(p<0.05).结果表明:CR1aa培养液适用于延边黄牛重组胚的体外培养,以CR1aa液+输卵管上皮细胞和TCM-199液+颗粒细胞共培养的形式效果更好(p<0.05).

哺乳动物卵的成熟分裂和孤雌胚与重组胚的发育(英文)

哺乳动物卵从出生前的胚胎时期开始成熟分裂，出生时到达双线期。此时为减数分裂的休止期，卵母细胞有一个明显的核即生发泡。生殖期中，在每一发情周期都有一些卵母细胞继续其减数分裂过程，发育成熟。排卵前减数分裂从核网期开始，包括生发泡破裂和排出第一极体。排卵时休止于第二次减数分裂中期，这些卵只有与精子相遇受精或人工激活才能排出第二极体，完成第二次减数分裂。尔后，受精卵或人工激活卵可在体内或体外发育成胚胎。哺乳动物个体发育过程中，从配子发生至囊胚期各发育阶段的细胞具有全能性与可塑性，可通过体外操作增加数量和改变质量以提高家畜的生产性能。因而，加强对这一发育阶段的研究具有重要的理论意义和实际应用价值。文章将论述其研究进展，包括减数分裂的休止与启动的调控，卵的精子激活与人工激活，受精胚、孤雌胚和重组胚的体内与体外发育以及雄性和雌性基因组在个体发育中的作用。

梅山猪耳组织成纤维细胞及其处理对核移植重组胚发育的影响

为研究供体细胞不同处理方法对核移植重构胚发育能力的影响,分别用血清饥饿不同时间和传代次数的供体细胞进行核移植,比较重组胚的卵裂率和囊胚率。结果发现,饥饿0、2、4、8d的核供体细胞,重组胚在卵裂率上没有表现显著的差异,而饥饿2d和4d试验组的囊胚率却显著高于其他组;以传代0、2、4、8代的细胞作为供体细胞进行核移植,未经传代的细胞直接作为核供体卵裂率为57.69%,明显低于经过传代的细胞;细胞的传代次数在重组胚卵裂率上并未表现出明显的不同,但传至第4代细胞构成重组胚的卵裂率和囊胚率最高(86.29%和23.36%)。试验选取饥饿处理2d、传4代的成纤维细胞作为核移植的供体,挑选发育良好的重组胚移植到6头代孕母猪体内,3头代孕母猪在第1到第3个情期相继返情,1头在胚胎移植45d流产;2头没有返情,B超检查受孕,其中1头代孕母猪到预产期顺利产下6头健康胎儿。

兔胚胎细胞核移植重组胚的发育力

以兔为模型 ,对影响胚胎细胞核移植重组胚发育力的电融合与激活参数、体外培养系统进行了探索性研究。结果表明 ,有利于重组胚发育力的适宜电融合与激活参数为 2 0 0 V/ m m的电场强度、10 0μs的脉冲宽度 ;在不同的体外培养系统中 ,TCM- 199培养液内于兔胎儿成纤维细胞饲养层 (REF feeder)上共同培养的重组胚获得了最高的 2～ 4-细胞发育率和桑椹胚或囊胚的发育率 ,分别为 6 5 .7%和 2 2 .9%;移植 111枚重组胚给 9只假孕母兔 ,其中 2只妊娠 ,1只完成足月妊娠产出 2只克隆仔兔 ,另 1只在妊娠 2 2 d流产 1只克隆死胎。

猪胚胎细胞核移植重组胚发育能力的研究

选用香猪 2 ～ 16 细胞期卵裂球作核供体 ,上海白猪卵母细胞作核受体。通过显微操作和电融合技术构成重组胚。体外培养时 ,以融合前 1h激活、融合前 2h激活及融合前不激活的卵母细胞作核受体的重组胚 ,发育率分别为 6 5 .8% ,5 3.1% ,33.3%。以体内、体外成熟卵母细胞作核受体胞质时 ,其重组胚的发育能力无显著变化 (P >0 .0 5 )。作为核供体的胚胎对于重组胚的发育能力有显著影响 ,母体合子转变以后的胚胎作为核供体时 ,重组胚的发育能力下降 ;分别以不同细胞期胚胎 (2 ,4 ,8 和 16 细胞 )的卵裂球作为核供体的NT胚发育率有显著差异 (P <0 .0 5 ) ,以 2 ～ 4 细胞胚胎卵裂球作核供体最合适。

哺乳动物核质重组胚后成性重序的机制

研究表明,供体核不完全或者不正确的后成性重序可能是核移植失败的主要原因。文章综述了哺乳动物核质重组胚中存在的几种不同的后成性重序机制,包括DNA甲基化、染色质重构、基因组印记与X染色体失活、端粒维持以及其他后成性遗传机制。理解重组胚后成性重序的机制将有助于我们解决核移植技术中存在的问题,进而促进它的应用。

金属螯合剂对延边黄牛体细胞核移植重组胚发育的影响

由于在核移植试验中,所用的水和化学物质都不可避免的会被一些金属离子轻微污染,造成胚胎内抗氧化物和过氧化物之间难以保持平衡,从而导致胚胎发育率降低,本试验以此为出发点,探讨了在延边黄牛体细胞核移植重组胚早期培养液中添加乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na)和柠檬酸钠(sodium citrate)2种金属螯合剂类抗氧化剂,对其后续发育的影响,以期筛选出最佳的体外培养条件。结果表明:适合延边黄牛体细胞核移植重组胚后期发育的EDTA-Na和柠檬酸钠的最佳浓度分别为50μmol/L和0.6mmol/L。

小分子硫醇对延边黄牛体细胞核移植重组胚发育的影响

探讨了在延边黄牛体细胞核移植重组胚早期培养液中添加L-半胱氨酸和β-巯基乙醇(β-ME)两种小分子硫醇类抗氧化剂,对其后续发育的影响,以期筛选出最佳的体外培养条件。结果表明:适合延边黄牛体细胞核移植重组胚后期发育的L-半胱氨酸和β-巯基乙醇的最佳浓度分别为0.6 mmol/L和50μmol/L。

影响兔胚胎细胞核移植效率的因素

对兔胚胎细胞核移植(NT)的有关影响因素进行了系统研究。结果发现电场强度100V·mm-1,脉冲时间15μs,电脉冲3～4次的融合率显著高于其它组(P<0.05);融合前激活卵母细胞,分裂率和囊胚率显著高于融合后激活(P<0.05);当用8～16-细胞胚胎的卵裂球作供核时,卵裂率和囊胚率显著高于致密桑椹胚卵裂球为供核组;当重组胚在含3%发情牛血清(OCS)的TCM199中培养48h后,转入含10%FCS的TCM199中继续培养,卵裂率和囊胚率显著高于一直在3%OCS或10%胎犊血清(FCS)中培养的重组胚(P<0.05)。将22枚2～4-细胞期重组胚移入同期发情的受体母兔输卵管内,34d后产下NT仔兔1只。结果表明,电融合参数和供体胚胎的发育阶段以及受体卵母细胞的状态对NT效果有显著影响,在NT胚胎的不同发育阶段采用不同的血清种类和浓度可提高其胚胎发育能力。

不同类型供体细胞对牛体细胞重构胚发育能力的影响

通过显微操作去除体外成熟培养22￣23h卵母细胞的细胞核,并通过细胞质内注射法将供体细胞核移入去核卵母细胞内构建重组胚,重组胚经离子霉素(Ionomycin)激活5min后,再在6-DMAP内培养4h,将重组胚转CR1培养液中进行培养,24h和36h检查卵裂率,培养8d后统计囊胚发育率。比较了经血清饥饿和未饥饿牛成纤维细胞、颗粒细胞作为供体细胞构建的重组胚。研究发现:未饥饿组的牛成纤维细胞重组胚囊胚发育率(11.76%)显著高于血清饥饿组重组胚囊胚发育率(3.16%,p<0.05)。未饥饿组颗粒细胞囊胚发育率(14.94%)也显著高于血清饥饿组(7.14%,p<0.05)。经血清饥饿处理的颗粒细胞和成纤维细胞重组胚发育率差异不显著(p>0.05),未饥饿处理组两种细胞的重组胚发育率差异不显著。结果表明,用非饥饿处理牛成纤维细胞及颗粒细胞重组胚的发育率较高,牛颗粒细胞更有利于重新程序化。

减少细胞质对激活小鼠卵母细胞体外发育的影响

以溶液的表面张力为主要动力 ,辅以显微操作法去除一定量的卵母细胞胞质。测量了去除的细胞质体的直径 ,第一组为 38.6 4 μm ,第二组为 6 1.5 2 μm。小鼠卵母细胞的平均直径为 80 μm ,则第一组细胞质体占卵母细胞体积的 11.3% ,第二组细胞质体占卵母细胞体积的 4 5 .5 %。去除细胞质后两组卵母细胞均被氯化锶激活 ,其培养后卵裂率没有显著差异 (80 .0 %vs 77.9% ) ,两者都显著低于未经去质处理的激活卵母细胞和受精卵的卵裂率。两者的囊胚发育率虽没有显著差异 (37.3%vs 36 .8% ) ,但均显著低于未经去质处理的激活卵母细胞和受精卵的囊胚发育率 (4 8.3%和 73.3% )。去除 11.3%和 4 5 .5 %细胞质的卵母细胞孤雌激活胚、未经去质处理的激活卵母细胞和受精卵 ,体外培养的囊胚细胞数 (17.2 8± 7.16 ,11.5 0± 6 .83,2 1.86± 7.5 2 ,4 4 .6 7± 6 .86 ) ,各组间差异显著。

不同融合液对延边黄牛体细胞核移植效率的影响

[目的]探寻适宜延边黄牛体细胞核移植的最佳融合液。[方法]用延边黄牛颗粒细胞为供体细胞。试验1,比较3种浓度(0.25、0.280、.30 mol/L)3种融合液(蔗糖、D-山梨醇、甘露醇)对核移植胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。试验2,比较3种0.28 mol/L融合液对核移植效率的影响。[结果]3种浓度的蔗糖、D-山梨醇、甘露醇融合液的融合率和卵裂率差异均不显著,但0.28 mol/L融合液处理的重组胚后期发育相对较好。3组融合液融合率(88.44%、86.83%、86.85%)差异不显著,蔗糖、甘露醇融合液卵裂率(87.98%、86.06%)差异不显著,在0.05水平上显著高于D-山梨醇融合液(78.64%);蔗糖、甘露醇融合液囊胚发育率(22.16%、19.91%)差异不显著,在0.05水平上显著高于D-山梨醇融合液(10.14%)。[结论]适宜延边黄牛体细胞核移植的最佳融合液为0.28 mol/L蔗糖融合液。

延边黄牛体细胞克隆激活条件的研究

从激活前恢复时间、激活方式、激活培养时间等3个方面研究延边黄牛体细胞克隆的适宜激活条件．结果表明：延边黄牛体细胞克隆激活的理想条件为激活前恢复培养25～30min，采用离子霉素（Ionomycin，Ion）＋6-Dimethyaminopurin（6-DMAP）激活方式，激活培养4h．

哺乳动物克隆技术研究进展

哺乳动物克隆是目前生物技术领域研究的热点之一 ,具有重大的科学意义和应用价值。文章着重介绍了哺乳动物克隆细胞核移植方法和进展 。

延边黄牛体细胞克隆融合条件的研究

以体外成熟培养22~24 h的延边黄牛卵母细胞作为受体,颗粒细胞为供核细胞,挤压法去核,注入供体颗粒细胞到卵黄周隙中,甘露醇融合液中施加20μs时长的电脉冲刺激使之融合,复合化学方法激活,从融合前恢复培养时间、融合电场强度、甘露醇浓度等3个方面研究延边黄牛体细胞克隆的适宜融合条件.结果表明,2.5 h处理组的融合率(70.9%)显著高于4.0 h处理组(58.2%,P<0.05),2.5 h处理组重组胚的卵裂率(77.9%)显著高于其它4组(P<0.05),其它各组间差异不显著(P>0.05);融合电场强度1 100 V/cm处理组的融合率(86.4%)显著高于900 V/cm处理组(67.1%)和1 200 V/cm处理组(75.2%,P<0.05),重组胚的卵裂率(84.6%)显著高于900 V/cm处理组(69.6%,P<0.05),囊胚发育率(26.1%)显著高于900 V/cm处理组(10.0%),1 200 V/cm处理组(8.0%,P<0.05);不同浓度的甘露醇对融合率和重组胚的卵裂率没有明显的影响,但是0.28 mol/L组囊胚发育率(25.3%)显著高于0.25 mol/L组(15.3%,P<0.05).因此,适合延边黄牛体细胞克隆的融合条件为融合前恢复培养2.5 h,0.28 mol/L甘露醇作为融合液,电场强度1 100 V/cm.

克隆兔能给人类带来什么?

广西大学动物繁殖研究所的科研人员日前成功地繁殖了一只胚胎细胞克隆兔。记者在实验室看到,这只出生于5月13日的胚胎克隆兔现在已经能够蹦跳,看上去发育良好,健康而活泼。主持这项研究工作的石德顺研究员说,他们先从一只兔子身上获得早期胚胎,注入已去除细胞核的成熟卵母细胞中,融合形成重组胚。重组胚在体外培养后,于4月9日被移入一只雌性兔子的输卵管内,经过34天的正常孕期,克隆兔顺利降生。这只胚胎细胞克隆兔出生时,重82克,现在体重已增至数倍。