重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(二)

二、适用范围本指导原则中的rAAV载体是指基于腺相关病毒的结构和理化特性,经设计和重组改造所形成的用于携带外源目的基因(或核酸片段)的病毒载体。本指导原则主要针对应用于体内基因治疗的rAAV载体类产品在申报临床试验时应完成和提交的药学研究信息提出建议。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(七)

六、质量研究与质量标准1.质量研究rAAV载体类产品的质量研究应根据产品的设计、作用机制和生产工艺等方面确定,一般包括(但不限于):鉴别、结构分析、一般理化特性、含量、纯度、生物学活性、杂质、污染物检测等。研究样品应具有代表性,如工艺相近或相同的非临床研究用样品、临床试验用药品等。质量研究信息应完整,包括分析方法原理介绍、研究样品、试验条件和基本步骤、数据处理和结果分析等,分析方法应能满足预期用途。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(一)

一、前言体内基因治疗产品一般选用适当的载体或转染方式将外源基因(或基因编辑工具)导入人体,通过替代、补偿、阻断、修正特定基因以达到治疗疾病的目的。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体因其理化性质稳定、致病性弱、整合风险低、外源基因表达持久等结构和生物学方面的优势,已成为体内基因治疗领域研究、应用最为广泛的载体之一。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(六)

五、生产工艺通过前期的工艺开发和临床试验用药品的制备,应能建立并初步证明生产工艺的合理性和可重复性,拟定工艺应能稳定生产出符合预期质量的临床试验用药品。申报资料须明确临床试验用药品的生产厂和检验厂,提供基本的生产工艺信息,包括生产规模、工艺流程、具体的工艺参数、过程中控制信息、批次定义等。工艺开发信息应能支持临床试验用药品生产工艺设定的合理性,如质粒瞬转工艺中质粒的用量和配比、杆状病毒感染工艺中的病毒用量和比例、病毒收获条件、纯化工艺条件、制剂处方筛选等。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(三)

三、一般原则临床试验申报阶段,rAAV载体类产品可参考《中国药典》的相关要求(尤其是“人用基因治疗制品总论”的要求),结合申报阶段的特点,制定合理的药学研究计划和质量控制策略。临床试验用药品应按照“《药品生产质量管理规范(2010年修订)》临床试验用药品附录”(2022年第43号)的相关要求进行生产。临床试验用药品的研发、生产、使用和废弃处理应符合生物安全相关法律法规的要求。

重组腺相关病毒基因药物临床前评价方法的回顾与展望

重组腺相关病毒(rAAV)基因药物在临床应用过程中长期疗效不确定,甚至存在安全性风险,是制约其广泛应用的主要障碍.对现有rAAV基因药物临床前评价方法进行分析和梳理.结果表明:仅进行药效学评价不能揭示rAAV转导的细胞和分子机制,而基于转导过程分析的物理转导与功能转导评价存在结果不一致,不能反映rAAV转导的细胞异质性和靶细胞的空间分布特征等问题,难以准确预测rAAV基因药物的临床疗效和安全性,需要从单分子、单细胞水平开展rAAV载体胞内命运评价的新方法,以切实保障新型rAAV基因药物的临床有效性和安全性.

西多福韦促进2型重组腺相关病毒体外转导分析

为研究小分子药物西多福韦(CDV)对2型重组腺相关病毒(rAAV2)体外转导效率的影响,采用不同剂量CDV干预rAAV2-GFP和rAAV2-LacZ载体转导Hela细胞,从转基因表达量、阳性细胞数量、胞内病毒基因组数等方面研究CDV对rAAV2转导的影响.结果表明,CDV能促进rAAV2体外转导Hela细胞,转基因表达量、阳性细胞数、胞内病毒基因组数与对照组相比,差异具有统计学意义,且其促进作用呈现一定的剂量和时间依赖性.

重组腺相关病毒协同重组腺病毒增强目的基因表达的体内试验

目的研究重组腺相关病毒(rAAV)协同重组腺病毒(AdV)在体内增强目的基因表达的强度及时间变化。方法人EB病毒阳性鼻咽癌细胞株C666-1接种于裸鼠皮下,待肿瘤直径达到3 mm左右以rAAV-EGFP 1.5×1011v.g(病毒基因组数,vi-rus genome)、rAdV-EGFP 2.5×108pfu或其等量混合液采用瘤内注射,于注射后第5天、10天分别处死裸鼠,取注射点周围肿瘤组织以10%PBS福尔马林固定,用免疫组化方法检测GFP表达情况,在400×光学显微镜下计数具有代表性的10个视野下的阳性细胞比例及强度,采用SPSS10.0单项方差分析统计结果。结果免疫组化提示瘤内注射病毒后第5天rAAV组开始表达目的基因(1.70±0.48),rAdV组目的基因表达达到高峰(6.00±1.94),联合组表达量与AdV组基本一致(6.90±1.92);第10天rAdV组目的基因表达基本消失(2.00±0.67),rAAV组表达明显升高(8.00±1.15),联合组持续高表达(10.10±1.63),且较rAAV组有显著差异(P=0.001)。结论 rAAV协同rAdV能够显著提高目的基因的表达量,能够使目的基因表达迅速且维持较长时间,可相互弥补两种病毒的不足,是一种值得推荐的基因表达方式。

重组腺相关病毒介导人源性神经肽Y基因转染对红藻氨酸致痫大鼠行为及脑电图的影响

目的探讨重组腺相关病毒介导人源性神经肽Y基因(rAAV2/1-hNPY-EGFP)转染对红藻氨酸(kainicacid,KA)诱导大鼠癫痫发作行为和脑电图的影响。方法 66只雄性Wistar大鼠分为点燃组(n=54)和对照组(n=12)。点燃组以大鼠右侧海马CA3区注射0.4μg/μlKA1.5μl5次造成慢性癫痫大鼠模型后,又随机分为KA组、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)组和神经肽Y(neuropeptide,NPY)组(n=18)。EGFP组脑室注射rAAV2/1-EGFP10μl,滴度为5×1011/ml;NPY组注射rAAV2/1-hNPY-EGFP10μl,滴度为5×1011/ml。分别于注射后2、3、4周,再次右侧海马CA3区注射1.5μlKA诱导癫痫发作,观察各组大鼠的行为和脑电图改变。结果对照组无癫痫发作;在发作级别、发作潜伏期、脑电痫波密度和脑电波幅方面,2、3周时NPY组与KA组、EGFP组相比无明显差异(P>0.05);4周时NPY组与KA组、EGFP组相比有明显差异(P<0.05),表现为发作级别降低,发作潜伏期延长,脑电痫波密度和脑电波幅均减少。结论 rAAV2/1-hNPY-EGFP基因转染可以抑制KA诱导的大鼠癫痫发作和海马神经元放电。

9型重组腺相关病毒转染体外培养大鼠心肌细胞的影响

目的:研究含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的9型重组腺相关病毒(rAAV9)对大鼠心肌H9C2细胞的转染及对细胞生长的影响。方法:rAAV9-EGFP按转染复数(MOI)1×105、1×106、1×107转染H9C2细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察H9C2细胞中EGFP阳性表达情况,采用流式细胞仪检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞的转染效率。观察转染后细胞生长形态,并用AlamarBlue法检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞增殖影响。结果:转染后第1天,MOI=1×106、1×107组中EGFP开始表达;第2天,MOI=1×105组开始表达,各组EGFP表达强度随MOI值的增高而增强,同时EGFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强;转染后第4天达到高峰,此时流式细胞术检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞的转染率分别为MOI=1×105组:(14.1±0.2)%、MOI=1×106组:(35.1±4.8)%、MOI=1×107组:(56.8±0.1)%。rAAV9-EGFP转染H9C2细胞后,细胞生长及形态正常,AlamarBlue法进一步检测表明转染组对H9C2细胞增殖无影响。结论:rAAV9-EGFP能够有效地转染H9C2细胞,且rAAV9-EGFP对H9C2细胞增殖无明显抑制。

2型重组腺相关病毒介导的β-地中海贫血基因治疗实验

目的探讨2型重组腺相关病毒(rAAV2)能否有效转染重型β-地中海贫血患者造血细胞,通过体外途径基因治疗地中海贫血。方法 6只BALB/c裸小鼠分为转染组(n=4)和未转染组(n=2),经X射线照射后,分别移植入经rAAV2β-珠蛋白病毒转染(MOI=50)或未转染的β41-42/β654杂合子型重型β-地中海贫血流产胎儿造血细胞,转染后第28天和第70天分别处死rAAV2转染小鼠(n=2)和未转染受体小鼠(n=1)。采用RT-PCR、等位基因特异性PCR(ASPCR)法检测rAAV2介导的人β-珠蛋白基因在小鼠骨髓中的表达,并以高压液相色谱法量化分析受体小鼠外周血中人β-珠蛋白肽链的水平。结果①RT-PCR于所有受体小鼠样本中均可检测到人β-actin和人β-珠蛋白基因的表达。②ASPCR检测中,β41-42突变基因稳定表达于所有受体小鼠,β654突变基因仅在移植后第70天受体小鼠样本中被检测到;移植后第28天,rAAV2转染及未转染小鼠体内均可检测到主要来自于β654突变基因的正常β-珠蛋白基因表达;但至移植后第70天,仅rAAV2转染小鼠骨髓样本中仍可检测到rAAV2-β-globin载体介导的正常β-珠蛋白基因表达。③移植后第70天处死的转染小鼠外周血中人β链/α链分别为0.328和0.325,相对未转染组0.135的比值,两者的增加百分比高达144.78%和142.54%。结论经rAAV2介导基因修饰后的重型β-地中海贫血患者造血细胞在体内可长期稳定表达正常人β-珠蛋白基因,而其分化产生的外周血人红系细胞内β-珠蛋白肽链的合成增加。

重组腺相关病毒介导RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞影响的动物试验

目的探讨EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP-1)对于鼻咽癌细胞在体内增殖及转移能力的影响。方法设计针对EBV-LMP-1的特异性发夹状RNA(shRNA)干扰序列,构建2种重组腺相关病毒(rAAV)载体:(增强型绿色荧光蛋白,EGFP)rAAV-EGFP和rAAV-shRNA-LMP-1,以不同滴度rAAV-EGFP转染鼻咽癌C666-1细胞确定最佳转染复数(MOI),rAAV-shRNA-LMP-1按MOI转染C666-1,RT-PCR鉴定抑制效率,将体外转染RNA干扰后的C666-1细胞注入裸鼠肝脏包膜下制作鼻咽癌异位肝种植的肝肺转移模型,观察肝脏成瘤及肝内、肺转移情况,分析LMP-1基因沉默在动物水平对鼻咽癌细胞成瘤及转移能力的影响。结果rAAV-EGFP以5×104v.g(virus genome,病毒基因组数)/细胞转染C666-1细胞,转染效率大于95%,RT-PCR鉴定rAAV-shRNA-LMP-1以5×104v.g/细胞转染C666-1后目的基因抑制效率大于90%,动物试验结果显示rAAV-shRNA-LMP-1组肝脏成瘤体积与对照组rAAV-EGFP无显著差异,但显著减少了种植肿瘤的肝内及肺转移率。结论通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP-1基因表达,可在动物水平抑制鼻咽癌细胞转移,但对鼻咽癌细胞生长无显著影响。

重组腺相关病毒经不同途径转染鼠眼球组织

目的 研究重组腺相关病毒 (rAAV)介导的报告基因 (LacZ)能否转染到鼠的眼球组织 ;以及rAAV LacZ在眼内转染的最佳途径。方法 2 0只SD大鼠随机分成 4组 ;第 1组 ,用rAAV LacZ(10 9个病毒颗粒·mL-1)溶液滴眼 ;第 2组 ,结膜囊注射 2 0 μLrAAV LacZ ;第 3组 ,前房注射 10 μLrAAV LacZ ;第 4组 ,玻璃体腔注射 10 μLrAAV LacZ。LacZ基因转染 30d后 ,分别取各组大鼠的眼球行 5 溴 4 氯 3 吲哚 β D 半乳糖苷 (X gal)组织化学染色 ,评价报告基因在眼球的表达情况。结果 X gal组织化学染色证实 ,用rAAV LacZ溶液滴眼 ,仅少量报告基因可以在角膜上皮层表达 ;结膜囊注射rAAV LacZ ,报告基因仅表达于结膜下组织 ;前房注射rAAV LacZ ,报告基因可表达于角膜和虹膜组织 ;玻璃体腔注射rAAV LacZ后 ,报告基因可表达于视网膜组织。结论 rAAV载体能定向携载报告基因到眼内组织 。

重组腺相关病毒介导的报告基因在角膜内皮细胞中的表达

目的研究重组腺相关病毒(rAAV)能否介导报告基因(Lacz)转移至大鼠的角膜内皮细胞;以及眼内炎症反应能否增强报告基因在大鼠角膜内皮细胞的表达。方法20只SD大鼠前房注射rAAV-Lacz(109Pfu),28d后,随机抽取10只SD大鼠为实验组,玻璃体腔注射脂多糖溶液(LPS)诱发眼内炎症;对照组(10只)玻璃体腔注射PBS溶液。2d后,分别取两组大鼠的角膜行5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)组织化学染色,评价报告基因的表达情况。结果X-gal组织化学染色证实,经前房注射,报告基因可以在角膜内皮细胞表达,对照组表达效率为5.12%±0.03%;玻璃体腔注射LPS溶液2d后,眼内出现明显的炎症反应,此时报告基因在角膜内皮细胞的表达效率为46.03%±2.12%,较对照组明显增强,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论rAAV载体能有效携载目的基因至角膜内皮细胞,炎症可增强rAAV载体介导的报告基因在角膜内皮的表达。

大鼠CTLA4-FasL融合基因重组腺相关病毒载体的构建、制备及表达

目的检测大鼠CTLA4-FasL重组腺相关病毒载体感染大鼠关节炎性成纤维样滑膜细胞后目的基因的表达。方法构建大鼠CTLA4-FasL融合基因重组腺相关病毒载体,制备重组病毒,体外感染从佐剂诱导关节炎的大鼠关节中分离的炎性成纤维样滑膜细胞,利用Flag标签纯化目的蛋白,ELISA和Western blot等方法检测目的蛋白的表达。结果获得含有大鼠CTLA4-FasL融合基因的重组腺相关病毒,感染炎性成纤维样滑膜细胞后能够分泌性表达目的蛋白。结论构建并制备的CTLA4-FasL重组腺相关病毒能够有效感染炎性成纤维样滑膜细胞并促使期表达CTLA4-FasL融合蛋白,为今后关节炎治疗的体内实验研究奠定了基础。

2型重组腺相关病毒对人脐血CD34^+造血干/祖细胞的转导效率研究

为探讨 2型重组腺相关病毒 (rAAV 2 )载体能否有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,采用rAAV 2 /GFP感染经免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,在荧光显微镜下观察GFP的表达。结果显示 ,转导 19小时后感染复数 (MOI)为 2× 10 5时 ,CD34+细胞GFP基因的表达率为 4 3%。结论 :rAAV 2能有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞。

DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)载体,并观察感染PC12细胞后DREAM蛋白表达受抑制情况。方法设计并合成shRNA对应的2条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,构建pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6质粒,以其为模板设计引物并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物酶切后与pSANV2.0连接构建重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,酶切测序证实后,重组腺相关病毒介导将pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP感染PC12细胞,Western blot检测DREAM蛋白表达水平。结果经PCR、酶切及测序证实,重组腺相关病毒载体质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP构建成功,包装成病毒感染PC12细胞48 h后,Western blot结果显示与对照组细胞相比,DREAM蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论成功构建和筛选出介导特异性shRNA-DREAM的重组腺相关病毒载体。

携带CIP2A shRNA重组腺相关病毒载体的构建及其鉴定

目的构建携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体,制备靶向性沉默CIP2A表达的高浓度重组腺相关病毒。方法设计合成CIP2AshRNA,退火形成双链与pDC316-EGFP-U6质粒BamHⅠ和HindⅢ双酶切产物相连接构建形成质粒pDC316-EGFP-CIP2AshRNA,以鉴定正确的pDC316-EGFP-CIP2AshRNA克隆为模板PCR扩增EGFPCIP2AshRNA片段,EcoRⅠ和SalⅠ双酶切PCR扩增产物及pSNAV2.0质粒后进行连接形成重组质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA,建立载体细胞株BHK/CIP2A-shRNA,采用AAV MaxTM包装系统大规模制备rAAV2-EGFPCIP2AshRNA并对其纯化及滴度测定。将rAAV2-EGFP-CIP2AshRNA感染肝癌细胞HepG2,利用空载病毒载体rAAV2-EGFP作对照,采用Real-time PCR及Western blot方法检测CIP2AshRNA基因沉默效果。结果携带编码CIP2AshRNA腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;将重组质粒与辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2共转染包装细胞BHK-21,成功制备重组腺相关病毒rAAV2-CIP2AshRNA,经测定纯化所得rAVV2病毒滴度为0.25×1012v.g./mL。筛选MOI值为1×105感染肝癌细胞HepG2,CIP2A mRNA及蛋白表达水平分别于感染后24h和48h与对照细胞相比出现明显下降。结论成功制备高滴度携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体rAAV2-CIP2AshRNA。

强力霉素诱导携带人血管内皮生长因子A-shRNA的1/2型重组腺相关病毒的包装及鉴定

目的通过Helper-Free腺相关病毒包装系统包装由强力霉素(doxycycline,DOX)诱导的携带hVEGFA-shRNA-GFP的1/2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV),测定病毒滴度并检测其对人视网膜血管内皮细胞(human ret-inal vascular endothelial cell,HRVEC)血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor,VEGFA)的敲除作用。方法将AAV-293细胞复苏、培养后传代。用磷酸钙转染法将质粒pAAV-hVEGFA-shRNA-GFP、1/2型腺相关病毒质粒(pAAV1/2)和pHelper质粒共转染AAV-293细胞,包装生成带有hVEGFA-shRNA-GFP的1/2型rAAV,将此rAAV感染AAV-293细胞,荧光显微镜观察病毒转染和感染效率。斑点杂交法测定病毒滴度。将HRVEC分为3组培养,正常对照组、HRVEC+rAAV组及HRVEC+rAAV+DOX诱导组,Western-blotting法检测VEGFA的敲除作用。结果 3种质粒共转染AAV-293细胞,发现病毒包装过程中细胞培养基颜色由红色变为橘黄色,细胞变圆并脱离培养皿底部,漂浮于培养基中。荧光显微镜下观察可见,24h后AAV-293细胞表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP),72h表达GFP细胞数比例可达95%～100%;共转染成功,包装得到DOX诱导的携带有hVEGFA-shRNA-GFP的1/2型rAAV,斑点杂交法检测病毒滴度为1015v.g.·L-1。HRVEC于重组病毒感染后第3天高表达GFP。免疫印迹法检测正常对照组、HRVEC+rAAV组及HRVEC+rAAV+DOX诱导组HRVEC中VEGFA表达量的变化发现:HRVEC+rAAV组其VEGFA表达量较正常对照组明显下降,HRVEC+rAAV+DOX诱导组其VEG-FA表达量较HRVEC+rAAV组明显降低。提示rAAV对细胞内VEGFA具有显著的敲除作用,并且DOX有加强VEGFA敲除的作用,病毒包装成功。结论 DOX诱导的携带有hVEGFA-shRNA-GFP的1/2型rAAV的包装获得成功,收获病毒具有较高滴度,能成功地感染HRVEC,并对HRVEC的VEGFA具有明显敲除作用,同时DOX有加强VEGFA敲除的作用,为眼底新生血管疾病基因治疗的研究提供了实验基础。

两种重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白转染大鼠成骨细胞效率的体外研究

目的比较2种不同重组腺相关病毒(rAAV)介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对大鼠成骨细胞的转染效率,评价其作为成骨细胞病变基因治疗载体的可行性。方法采用Ⅰ型胶原酶阶段消化法分离培养大鼠成骨细胞并鉴定,rAAV-EGFP按转染复数(MOI)1×103、1×104、1×105、5×105分为只加rAAV和rAAV与腺病毒(ADV)共同转染组转染成骨细胞,倒置荧光显微镜观察转染后荧光强度随转染时间的变化,流式细胞仪检测rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP对成骨细胞的转染效率及荧光强度,确定转染的较佳MOI值,以此值用MTT法描绘细胞生长曲线,观察rAAV对细胞的毒性。结果分离培养的细胞具有体内成骨细胞的生物学行为,rAAV对成骨细胞的转染效率随MOI值的增加而提高,ADV(-)组荧光强度在第5 d达到高峰,当MOI为1×105时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率分别为90.2%、66.1%,MOI值增到5×105时转染效率无显著提高;ADV(+)组荧光强度在第3 d即达高峰,MOI值为5×105时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率为47.6%、30.5%。细胞生长正常,rAAV对细胞活性影响小。结论两种病毒载体对成骨细胞转染效率均较高,其中rAAV2/6高于rAAV2/9,是一种理想的基因治疗载体。