腺病毒介导的血管内皮生长因子联合干细胞生长因子治疗严重肢体缺血的实验研究

目的 探究血管内皮生长因子(VEGF)和干细胞生长因子(HGF)双基因腺病毒载体在缺血组织中促血管生成的作用及疗效。方法 将84只昆明小鼠随机分为假手术组、空白对照组、VEGF组、HGF组、VEGF+HGF组,构建左侧下肢缺血模型,血流仪观察缺血组织血运情况,Western blot及ELISA检测各组小鼠不同时间点VEGF、HGF表达,免疫组织化学染色检测缺血组织的血管生成情况(CD31、SMA),以小鼠治疗期间副作用评估安全性。结果 建模成功后,各组小鼠左侧下肢血流流速均显著下降;术后第7天,各组小鼠左侧下肢血流流量均明显优于术后即刻(P <0.05),且Ad-VEGF-HGF组小鼠左下肢血流量明显优于其他各组(P <0.05);术后28 d Ad-VEGF-HGF组小鼠左下肢血流量逐步稳定,且术后Ad-VEGF-HGF组小鼠血流明显优于其余各组,且VEGF组、HGF组均显著优于对照组(P <0.05);Western Blot及ELISA检测发现术后7、14、28 d时Ad-HGF组、Ad-VEGF组、Ad-VEGF-HGF组HGF蛋白、VEGF蛋白均明显高于对照组(P <0.05),且14 d Ad-VEGF-HGF组的表达水平处于相对峰值(P <0.001),术后第28天时表达水平逐步降低至术前水平。结论 Ad-VEGF-HGF基因注射可显著提高小鼠体内VEGF和HGF蛋白的表达水平并快速达到相对峰值水平,继而进一步促进下肢缺血后的血管生成,增加血流量,改善下肢循环。

腺病毒介导的肝细胞生长因子/血管内皮生长因子165对大鼠超比例随意皮瓣成活的影响及机制研究

目的:观察术前注射腺病毒介导的肝细胞生长因子/血管内皮生长因子165(Ad-HGF/VEGF165)对大鼠超比例随意皮瓣成活的影响和其机制的初步研究。方法:大鼠背部设计超比例随意皮瓣模型,将其随机分为Ad-HGF/VEGF165组、AdVEGF165组和对照组。术前7 d,Ad-HGF/VEGF165组和Ad-VEGF165组分别于大鼠皮瓣及创缘内多点注射Ad-HGF/VEGF165及AdVEGF165,对照组注射等容量0.9%氯化钠注射液。分别于术后7 d、14 d观测皮瓣成活面积,切取皮瓣组织标本HE染色、免疫组化观察微血管密度及组织间VEGF阳性率等指标,WesternBlot检测目的蛋白表达情况。结果:术后7 d、14 d,Ad-HGF/VEGF165组、Ad-VEGF165组皮瓣存活面积、组织间微血管数目、VEGF及细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)蛋白表达情况均高于对照组(P<0.001),且Ad-HGF/VEGF165组明显高于Ad-VEGF165组(P<0.05)。结论:Ad-HGF/VEGF165具有协同作用,能显著促进VEGF和ERK1/2信号因子表达,短期内促进血管网重建,改善皮瓣血液灌注,提高大鼠超比例随意皮瓣成活面积。

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达

目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上,构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165,经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。结果:PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒,PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后,病毒效价可达(2.0～5.0)×1010pfu/mL。转染48h后,293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高(F=427.93,17.93,P<0.05)。结论:成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒,血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。

含血管内皮生长因子启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒的制备及其体外杀伤作用观察

目的应用AdEasier-1系统高效制备含血管内皮生长因子(VEGF)启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒并观察其体外肿瘤杀伤作用。方法以JM109细菌基因组为模板,PCR扩增出含HindⅢ/BamHⅠ酶切位点的CD基因,亚克隆到pREP8,继而用HindⅢ/XbaⅠ切出含pA加尾信号的CD基因,插入到预先构建的含VEGF启动子的转移质粒pAdtrack-VEGFP构建pAdtrack-VEGFP-CD。经PmeⅠ线性化后转化AdEasier-1细菌,用25 μg/ml卡那霉素筛选阳性克隆,先后进行琼脂糖电泳和PacⅠ酶切鉴定,筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CD。经293细胞包装、扩增获得重组腺病毒Ad-VEGFP-CD,行PCR鉴定。通过测定细胞克隆形成率和细胞存活率观察重组腺病毒对体外培养的LoVo细胞的细胞毒作用。结果构建重组腺病毒质粒的成功率为70%(7/10)。包装扩增后重组腺病毒的滴度为4.8×1012 CFU/ml,PCR扩增结果与预期相符。在前药5-氟胞嘧啶存在下,重组腺病毒对LoVo具有明显杀伤作用,细胞克隆形成率和细胞存活率都明显下降。结论应用AdEasier-1系统可以成功制备含VEGF启动子驱动CD自杀基因的重组腺病毒,该重组体具有明显的肿瘤杀伤作用。

血管内皮细胞生长因子165基因重组腺病毒的构建及其鉴定

目的:基因重组腺病毒具有较高的转染率,且宿主范围广。实验拟构建携带人血管内皮细胞生长因子165基因的重组腺病毒载体(Ad.VEGF165),为后续基因转染、微囊化基因工程细胞及其动物模型研究提供实验基础。方法:实验于2007-01/05在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所实验室完成(国家级重点实验室)。①实验材料:pAxCAwt.VEGF165由长海医院胸心外科研究所惠赠。②实验方法:采用脂质体转染法,将pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC共转染人胚肾293细胞,扩增后获得载人血管内皮细胞生长因子165基因的复制缺陷型重组腺病毒。③实验评估:应用聚合酶链反应及酶切证实重组腺病毒中的目的基因。并根据50%组织培养感染剂量法计算病毒滴度。结果:①重组腺病毒Ad.VEGF165的构建:采用脂质体法可使pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC有效转染人胚肾293细胞,扩增出载人血管内皮细胞生长因子165基因的复制缺陷型重组腺病毒。②重组腺病毒Ad.VEGF165的鉴定:聚合酶链反应的产物进行NcoⅠ酶切鉴定,可得到597bp、146bp2个片段,与GeneTool软件理论上计算的结果完全一致,计算病毒滴度为2.2×1015pfu/L。结论:采用pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC系统经脂质体转染法成功构建的复制缺陷的重组腺病毒Ad.VEGF165滴度高、毒性低、效率高、体外转染安全。

构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒在兔骨髓基质干细胞中的表达

目的:构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因共表达腺病毒并观察其在兔骨髓基质干细胞中的表达。方法:实验于2005-03/12在解放军第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所完成。①分别克隆人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因,分别依次亚克隆至穿梭载体构建重组穿梭质粒pAdT-B2V并酶切鉴定;后经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier-1Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP-7并酶切鉴定。②PacI酶切线性化后的pAdBMP-7腺病毒质粒转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP-7,在荧光显微镜下计算表达绿色荧光蛋白细胞个数,测定AdB2V滴度。③将AdBMP-7体外感染兔骨髓基质干细胞后,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达及反转录-聚合酶链反应方法鉴定外源基因的表达,以β-肌动蛋白为内参照,未感染细胞为对照。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后72h以免疫细胞化学染色方法检测外源基因的表达,以未感染组为对照。结果:①酶切鉴定表明外源基因已插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒pAdBMP-7构建成功。②经293细胞包装3d后可观察到绿色荧光蛋白表达,氯化铯梯度离心法最终获得约3×109efu/L滴度的重组腺病毒。③体外感染兔骨髓基质干细胞后荧光显微镜观察及反转录-聚合酶链反应证实外源基因可在兔骨髓基质干细胞中表达,未感染组为阴性。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后以免疫细胞化学染色均观察到外源基因的阳性表达,未感染组呈阴性表达。结论:成功构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒,证实了其在兔骨髓基质干细胞的表达,为骨再生的局部联和基因治疗打下基础。

重组腺病毒介导的血管内皮生长因子165在大鼠骨髓基质细胞中的表达

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建携带血管内皮生长因子165(VEGF165)的重组腺病毒(Ad-VEGF165),并观察Ad-VEGF165转染大鼠骨髓基质细胞(bMSCs)后VEGF165的表达情况。方法将PCR获取的VEGF165目的基因插入到pAdTrack-CMV中,构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165,经PmeI酶切线性化后,采用电穿孔法转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中,挑选同源重组菌落。提取质粒并用PacI酶切鉴定。线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞,包装成重组腺病毒颗粒,并扩增收集重组腺病毒,测定病毒滴度。体外培养大鼠骨髓基质细胞,Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞,转染后在荧光显微镜下观察。转染的骨髓基质细胞采用RT-PCR和ELISA法检测VEGF165的表达水平。结果经酶切鉴定,基因测序及绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒,并扩增出109pfu/ml的高滴度重组腺病毒。Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞后,RT-PCR证明转染的骨髓基质细胞内有VEGF165mRNA表达。ELISA检测发现转染组上清液中VEGF165蛋白分泌量明显高于对照组(P<0.01)。结论pAdEasy-VEGF165转染对骨髓基质细胞的增殖能力无明显影响,而且骨髓基质细胞能够表达并分泌VEGF165,为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础。

细菌内重组法快速构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体

背景:腺病毒载体具有在哺乳动物及其多种细胞基因转移和蛋白表达的高效性,目前以细菌内重组法构建病毒载体成为常用方法。目的:观察以细菌内重组法构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体的可行性。设计、时间及地点:基因转染病毒载体的单一样本实验,于2007-10/2008-02在中山大学分子生物实验室完成。材料:合成血管内皮生长因子165基因的引物合成和序列测定由上海生工公司提供。pDNR-1r质粒(已含有绿色荧光蛋白基因)、pInt.AV.spaT质粒、pInt.B.B质粒均购自广州拓普基因技术公司。方法:通过动态模板PCR基因合成法合成的血管内皮生长因子165基因克隆入pMD18-T载体获得pMD18-T-VEGF165。将pMD18-T-VEGF165和pDNR经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,构建pDNR-VEGF165载体,酶切鉴定后,pDNR-VEGF165与pInt.AV1.spat共转化BNN菌株的感受态细胞,构建pInt.AV1.spat.VEGF165腺病毒表达载体,将线性化的pInt.AV1.SpaT-VEGF165和pInt.B.B转染293细胞。主要观察指标:以DNA测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的感染效率。结果:重组质粒用EcoRⅠ酶切后,切成2条片段,大小约为1kb和6.9kb,实际的酶切分析结果与理论分析相符,证明转化子中的重组质粒为Cre-LoxP系统介导的含有血管内皮生长因子165基因的重组质粒。荧光显微镜下,8h后即可见部分细胞发出荧光,24h发荧光的细胞数及强度达到高峰,转染率超过80%。线性化的pInt.AV1.SpaT-VEGF165和pInt.B.B共转染293细胞,12～14d后会出现细胞病变效应。分别提取病变293细胞、正常293细胞的DNA,PCR后,1%琼脂糖凝胶电泳,病变的293细胞在约500bp处出现条带。结论:以细菌内重组法获得了含有成熟血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒。

血管内皮生长因子基因重组腺病毒载体的构建

目的 :构建携带人血管内皮生长因子基因的重组腺病毒载体。方法 :将人源性的 VEGF1 6 5c DNA正向插入到穿梭质粒 p HCMVSP1A的 CMV启动子之下 ,构建重组质粒 ,通过脂质体与 p JM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得携带人 VEGF1 6 5基因的重组腺病毒 ,通过 PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒 ,扩增、纯化并测定滴度。结果 :人VEGF1 6 5c DNA成功地正向插入到 p HCMVSP1A载体中 ,以重组病毒基因组 DNA为模板 ,同时扩增出 5 76 bp的VEGF1 6 5c DNA基因片段和 86 0 bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了所构建病毒的正确性 ,病毒滴度为 2 .5× 10 9pfu/ m l。结论 :成功构建了表达人 VEGF1 6 5基因重组腺病毒载体 ,使

重组腺病毒介导的反义血管内皮生长因子对胰腺癌细胞生长的抑制作用

目的 构建表达反义VEGF165的重组腺病毒,探讨腺病毒介导的VEGF165反义核酸治疗胰腺癌的可行性。方法 应用基因重组技术,将513 bp的人VEGF165 cDNA反向克隆到腺病毒粘粒载体pAxCAwt的Swa I酶切位点。重组粘粒与腺病毒DNA末端肽复合物混合后以磷酸钙共沉淀法转染293细胞,制备出表达反义VEGF165的重组腺病毒。建立胰腺癌裸鼠皮下种植瘤模型,瘤体内直接注射重组腺病毒,观察肿瘤的生长及血管生成情况。结果 成功构建了反义VEGF165腺病毒粘粒载体pAxCAwt-αVEGF,并制备出高滴度的反义VEGF165重组腺病毒,注入胰腺癌瘤体内后,治疗组肿瘤生长速度比对照组明显减慢（P<0.01）,治疗组肿瘤微血管密度也明显减少（P<0.01）。结论 反义VEGF165重组腺病毒可以抑制胰腺癌的血管生成和肿瘤生长,有潜在的应用价值。

重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达及其影响

目的观察重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因(AdVEGF165)转染后大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中血管内皮生长因子的表达情况以及腺病毒载体对大鼠骨髓间充质干细胞的生长影响情况。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,用腺病毒载体转染BMSCs。采用ELISA法检测血管内皮生长子因子(VEGF)的表达和分泌。转染后用胰酶消化传代培养,MTT法绘制细胞生长曲线。结果AdVEGF165转染组上清液中VEGF蛋白表达量极显著高于空白对照组(P<0.01)。且AdVEGF165转染BMSCs后,生长曲线与正常培养细胞无显著差异(P>0.05)。结论重组腺病毒载体能够在BMSCs中介导VEGF的表达,且对BMSCs生长无影响。

人血管内皮生长因子-D的重组腺病毒制备与鉴定

生物旁路是近年来缺血性心脏病治疗研究的一个新热点。本研究旨在构建人血管内皮生长因子 D重组腺病毒 ,为基因转染研究作准备。用重组粘粒和DNA TPC混合后 ,以磷酸钙共沉淀法转染 2 93细胞 ,获取重组腺病毒。重组粘粒插入方向及重组腺病毒均经酶切鉴定为正确。所得重组腺病毒为E1缺陷 ,可用于体内基因治疗研究。

血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建及转染内皮祖细胞的实验研究

目的:利用细菌内同源重组法构建含血管内皮生长因子(VEGF)165基因的重组腺病毒,并观察其在内皮祖细胞(EPCs)中的表达,为进一步研究其在慢性肾脏病中的作用奠定基础。方法:用限制性内切酶XbaⅠ+HindⅢ从质粒载体中切出VEGF165基因片段,与KpnⅠ+HindⅢ双酶切的pAdTrack-CMV形成转移质粒pAdTrack-CMV-VEGF165,PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,由人胚肾293细胞包装成Ad-VEGF165,PCR和Western blot法鉴定其表达。贴壁法体外培养获得大鼠骨髓来源的EPCs,Ad-VEGF165基因体外转染EPCs,检测转染后目的基因的表达情况。结果:利用CsCl2法由pAdTrack-VEGF165和pAdEasy-1共转化BJ5183感受态菌,可获得阳性重组体细菌克隆。PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因,病毒滴度1.4×1010pfu/ml。Ad-VEGF165转染培养第6天的EPCs后24h开始,培养上清中VEGF蛋白表达较对照组和转染前增加。结论:成功制备的重组体腺病毒Ad-VEGF165转染体外培养的EPCs后,在体外能有效高表达目的基因产物,为今后VEGF在肾脏病中的深入研究奠定了基础。

应用AdEasy腺病毒载体系统构建血管内皮生长因子165重组腺病毒

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建血管内皮生长因子165（VEGF165）重组腺病毒，并在293T细胞中扩增。方法将PCR获取的VEGF165基因酶切并插入到pAdTrack-CMV中，构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165，经PmeI酶切线性化后，采用电穿孔转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中，挑选同源重组菌落。提取质粒并用Pac I酶切鉴定，线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞，包装成重组腺病毒颗粒，荧光显微镜下观察绿色荧光表达，并扩增收集重组腺病毒，测定病毒滴度。结果经限制性内切酶检测、基因测序及和绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒，并扩增出10^9pfu／mL的高滴度重组腺病毒。结论成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒载体，为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础。

血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景:人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2在激素性股骨头坏死骨缺损中均具有成血管成骨作用,目前国内在以人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2基因联合治疗激素性股骨头坏死方面少有报道。目的:构建人血管内皮生长因子121与人骨形态发生蛋白2双基因腺病毒穿梭质粒。方法:将质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1经KpnⅠ/XbaⅠ酶切后,将BMP2片段定向连入pShuttle-CMV-VEGF121-IRES,构建可同时表达2个目的基因重组质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-BMP2,注入H5a细胞扩增,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析及序列测定。将已构建确认正确的腺病毒质粒,经BJ5183-AD-1电转感受态细胞进行电穿孔后,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析,PCR检测和序列分析。结果与结论:酶切分析及核酸序列测定证实重组质粒构建正确,提示实验成功构建了血管内皮生长121及骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体。

绿色荧光蛋白标记的人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建与鉴定携带绿色荧光蛋白标记的人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因的重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP。方法将hVEGF165基因进行扩增,并同源重组入表达质粒pAV-MCMV-HA-P2A-GFP,转化入DH5a感受态细胞,得到的转化子经菌落聚合酶链反应(PCR)鉴定和测序鉴定后,通过Ad Max腺病毒包装系统转染HEK293细胞,进行病毒的包装和扩增。包装后镜下观察HEK293细胞,测定腺病毒滴度,Western blot检测重组腺病毒的表达。结果成功构建了重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP,重组腺病毒转染的HEK293细胞出现了明显的细胞病变效应;获得重组腺病毒的滴度为1.106×10~8 IFU/mL;Western blot检测重组腺病毒表达在23 000左右。结论成功获得重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP,为进一步研究基因治疗脓毒症/感染性休克奠定了实验基础。

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达。万法:将人源性的VEGF165 cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达。结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610 bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108pfu／ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达。结论:成功构建了表达人VEGF165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础。

人血管生成素-1和血管内皮生长因子VEGF_(165)腺病毒载体构建

目的:克隆人血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor165,VEGF165)和血管生成素-1(angiopoietin-1)的全长编码基因,构建表达该基因的复制缺陷型腺病毒载体Ad-Ang1和Ad-VEGF165。方法:通过RT-PCR方法克隆人VEGF165和Ang1全长编码基因。Ad-VEGF165和Ad-Ang1通过同源重组方法构建。将Ad-VEGF165和/或Ad-Ang1转染大鼠胚胎心脏成肌细胞(H9C2)24h后,Westernblot方法分析VEGF165和Ang1蛋白表达量;核酸电泳分析细胞基因组降解检测凋亡水平。结果:测序显示VEGF165序列与基因库序列相同;Ang1序列与基因库序列存在一个碱基的差异,但编码氨基酸无改变。VEGF165和Ang1蛋白表达分别为对照组的11.65倍和3.53倍。Ad-VEGF165和/或Ad-Ang1转染后的H9C2细胞对过氧化氢诱导的细胞凋亡具有明显的抵抗能力。结论:所构建的Ad-Ang1和Ad-VEGF165能有效转染心脏成肌细胞,表达出功能性目的蛋白,具有抗细胞凋亡作用。

内皮抑素-可溶性血管内皮细胞生长抑制因子融合基因重组腺病毒的包装与鉴定

目的:构建内皮抑素-可溶性血管内皮细胞生长抑制因子融合基因重组腺病毒载体并包装成重组腺病毒,为下一步基因治疗打下基础。方法:用PCR方法在hENDO基因的5’端引入IL_3信号肽、3’端引入弹性蛋白连接肽序列(linker),再与sVEGI基因连接,插入到pCAl3腺病毒载体中,用脂质体介导包装出重组腺病毒,PCR法对重组腺病毒进行鉴定。结果:构建完成hENDO-sVEGI融合基因重组腺病毒载体,融合基因包括IL_3信号肽、hENDO全长基因、弹性蛋白连接肽序列和sVEGI基因,总长度约1114bp,经酶切鉴定、序列分析证实克隆序列、插入方向和读码框架均正确,可包装出携带融合基因的重组腺病毒,用TCID_(50)法测定粗制重组腺病毒滴度为2×10^(11) TCID_(50)/L。结论:成功构建了hENDO-sVEGI融合基因,连接肽序列使两蛋白空间构象不受影响,IL_3信号肽保证蛋白可被分泌至胞外,完成携带融合基因的重组腺病毒的包装与鉴定,为进一步开展肿瘤基因治疗研究奠定了基础。