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重组腺病毒对体外培养耳蜗Corti器的转染特性
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作者 王苹 杜波 +1 位作者 丁大连 杜宝东 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2007年第42期8453-8456,共4页
目的:腺病毒载体是在内耳基因治疗的实验研究中应用最广泛的载体之一,但载体的靶向性不明显。通过重组腺病毒携带报告基因EGFP转染体外培养耳蜗器官,观察各型细胞的转染特性。方法:实验于2004-08/2006-01在美国纽约州立大学布法罗分校... 目的:腺病毒载体是在内耳基因治疗的实验研究中应用最广泛的载体之一,但载体的靶向性不明显。通过重组腺病毒携带报告基因EGFP转染体外培养耳蜗器官,观察各型细胞的转染特性。方法:实验于2004-08/2006-01在美国纽约州立大学布法罗分校听力耳聋研究中心完成。①实验材料:Fisher大鼠来源于布法罗大学的实验动物中心。AdV/EGFP是Buffalo大学Dr.Lee惠赠。②实验方法:选取出生3d的大鼠分离获取耳蜗组织。使用携带报告基因-EGFP的重组腺病毒(AdV/EGFP),以1×107,1×108,1×109,2×109VP/mL作用耳蜗,于感染后6,12,24,48h和3d,固定组织,观察感染特性。分离出生3d的大鼠耳蜗Corti器,基底膜分离后,立即进入2mL滴度为1×109VP/mL,含2mmol/L的庆大霉素病毒溶液,作用3h后平铺到胶粒上,加入含2mmol/L庆大霉素的生长培养基,作用24h后收获样品。③实验评估:采用TRITC-labeledphaloidin组织化学染色,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白EGFP和TRIC在耳蜗细胞中的表达定位。结果:①重组腺病毒可转染离体培养耳蜗组织中的各种类型细胞,外沟细胞感染率最高,其次为齿间细胞。仅有很少部分的毛细胞和螺旋神经元被感染。②在病毒滴度在107~109VP/mL的范围内,重组腺病毒感染耳蜗具有剂量依赖性,但大于这个滴度并不会增加感染效率,而且高浓度的重组病毒可造成毛细胞和外沟细胞破坏。③EGFP最早于感染后6h出现,48h达到高峰,外源基因高表达至少可维持7d。④庆大霉素损伤所有的毛细胞后,重组腺病毒能够感染多数的Deiters’细胞,齿间细胞的感染效率高于腺病毒对正常耳蜗组织的感染。结论:重组腺病毒转染效率在耳蜗各种类型细胞明显不同,重组腺病毒优先感染耳蜗支持细胞。 展开更多
关键词 内耳 重组腺病毒 基因 组织工程 细胞工程
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上调Cx43对心肌细胞间通讯及离子通道的影响 被引量:3
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作者 唐良虎 李德 +3 位作者 杨大春 王强 马双陶 张彦 《西部医学》 2016年第3期312-316,320,共6页
目的通过重组腺病毒介导缝隙连接蛋白Cx43在体外培养的心肌细胞中过度表达,观察心肌细胞间通讯及细胞离子通道变化。方法通过RT-PCR法克隆SD大鼠缝隙连接蛋白Cx43基因的全长cDNA,用基因重组的方法构建腺病毒pAdEasy-1-Cx43。行心肌细胞... 目的通过重组腺病毒介导缝隙连接蛋白Cx43在体外培养的心肌细胞中过度表达,观察心肌细胞间通讯及细胞离子通道变化。方法通过RT-PCR法克隆SD大鼠缝隙连接蛋白Cx43基因的全长cDNA,用基因重组的方法构建腺病毒pAdEasy-1-Cx43。行心肌细胞基因转染后,分别用RT-PCR和蛋白质免疫印迹技术检测Cx43在心肌细胞中的mRNA和蛋白表达,用免疫荧光技术分析Cx43在心肌细胞膜上的分布。采用划痕标记荧光染料示踪(SLDT)技术观察培养心肌细胞群之间的罗氏黄(lucifer yellow,LY)染色传输,检测上调Cx43对心肌细胞间通讯的影响;采用单细胞膜片钳技术分析各离子通道电流的变化,观察上调Cx43对心肌细胞膜离子通道表达的影响。结果腺病毒重组质粒pAdEasy-1-Cx43构建成功;转染心肌细胞后,pAdEasy-1-CX43转染组Cx43mRNA及蛋白表达上调,且心肌细胞膜上分布较多;细胞划痕荧光染料示踪提示转染后,心肌细胞间通讯增强;膜片钳全细胞膜电流提示转染后钙内流降低,钾离子电流未发现有明显改变。结论成功构建腺病毒重组质粒pAdEasy-1-Cx43载体,隙连接蛋白Cx43表达上调增强了心肌细胞间通讯以及钙内流,为Cx43改善心室肌电重构,减少或预防室性心律失常发生的进一步研究打下了基础。 展开更多
关键词 重组腺病毒转染 缝隙连接蛋白CX43 细胞划痕荧光料示踪 细胞间通讯 膜片钳
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Expression of human yrdC gene promotes proliferation of gastric carcinoma cells 被引量:1
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作者 Tingsong Yang Xiaojun Shen +6 位作者 Jianwei Bi Shengdong Huang Guo Wei Hongliang Zhu Xiaojun Tang Yang Yuan Dejun Gong 《The Chinese-German Journal of Clinical Oncology》 CAS 2009年第8期433-437,共5页
Objective: The aim of the research was to study the function of human yrdC gene in the gastric carcinoma cells. Methods: Human yrdC gene was isolated from human spleen tissue by RT-PCR. Anti-human yrdC monoclonal an... Objective: The aim of the research was to study the function of human yrdC gene in the gastric carcinoma cells. Methods: Human yrdC gene was isolated from human spleen tissue by RT-PCR. Anti-human yrdC monoclonal antibody was prepared by hybridoma cell technique. Recombinant adenovirus Ad.yrdC carrying yrdC gene was constructed by using the AdEasy adenoviral vector system. Recombinant adenovirus Ad.yrdCshRNA mediated yrdCshRNA was prepared by RNA interference technology. Gastric adenocarcinoma BGC-823 cells of moderate differentiation were transfected and absorbance of the transfected cells was calculated at 490 nm by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method. Results: A value of the transfected Ad.yrdC group was significantly greater than that of the non-transfected and transfected Ad.Null groups, and A value of Ad.yrdCshRNA group was significantly lower than that of the non-transfected and transfected Ad.Null groups. Conclusion: Expression of yrdC gene has a function of promoting the proliferation of gastric carcinoma cells. 展开更多
关键词 human yrdC gene gastric carcinoma monoclonal antibody recombinant adenovirus
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