腺相关病毒感染GDF11对2型糖尿病大鼠血管损伤的保护作用

目的探讨腺相关病毒感染上调体内生长和分化因子11(GDF11)表达水平对2型糖尿病大鼠(T2DM)主动脉损伤的影响。方法随机选取9周龄雄性SD大鼠,采用高糖高脂饲料加小剂量链脲佐菌素(STZ)联合诱导,建立T2DM模型。正常大鼠和糖尿病模型大鼠随机分为5组:空白对照组(Control组)、阴性病毒对照组(NC组)、GDF11腺相关病毒组(GDF11组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病+GDF11腺相关病毒组(DM+GDF11组)。喂养8周后,检测大鼠血清中胰岛素(INS)、晚期糖基化终末产物(AGES)、重组生长转化因子11(GDF11)、总胆固醇(T-CHO)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、不对称二甲基精氨酸(ADMA)、丙二醛(MDA)浓度;采用过碘酸雪夫氏染色(PAS染色)观察糖原沉积部位,苏木精-伊红染色(HE)观察血管损伤情况,扫描电镜观察血管内皮细胞和血管弹性纤维损伤情况,蛋白印迹和免疫组化检测血管损伤相关蛋白的表达水平。结果在动物实验中与Control组相比,生化指标提示:DM组大鼠血清中AGES、T-CHO、TG、LDL-C和MDA浓度升高(P<0.05),INS、GDF11、HDL-C、ADMA显著低于Control组(P<0.05),DM+GDF11组AGES和HDL-C与DM组无明显差异,T-CHO、TG、LDL-C和MDA相比较DM组降低(P<0.05),INS、GDF11和ADMA相比较DM组升高(P<0.05)。病理染色提示:DM组PAS染色提示糖原颗粒在主动脉内皮及内皮下沉积,HE染色观察到主动脉中膜增厚,内皮细胞及弹性纤维断裂走形不规则,电镜观察到DM组血管内皮损伤,弹性纤维断裂,DM+GDF11组这些变化有所减轻。蛋白印迹和免疫组化表示内皮细胞相关蛋白在DM组中表达下降(P<0.05),间充质标志物在DM组中表达升高(P<0.05),DM+GDF11组中这些蛋白有所回调,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论提高体内GDF11表达水平可以改善糖尿病导致的主动脉血管损伤,推断可能与其抑制内皮间充质转化保护血管内皮细胞的功能从而改善血管损伤有关。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(二)

二、适用范围本指导原则中的rAAV载体是指基于腺相关病毒的结构和理化特性,经设计和重组改造所形成的用于携带外源目的基因(或核酸片段)的病毒载体。本指导原则主要针对应用于体内基因治疗的rAAV载体类产品在申报临床试验时应完成和提交的药学研究信息提出建议。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(七)

六、质量研究与质量标准1.质量研究rAAV载体类产品的质量研究应根据产品的设计、作用机制和生产工艺等方面确定,一般包括(但不限于):鉴别、结构分析、一般理化特性、含量、纯度、生物学活性、杂质、污染物检测等。研究样品应具有代表性,如工艺相近或相同的非临床研究用样品、临床试验用药品等。质量研究信息应完整,包括分析方法原理介绍、研究样品、试验条件和基本步骤、数据处理和结果分析等,分析方法应能满足预期用途。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(一)

一、前言体内基因治疗产品一般选用适当的载体或转染方式将外源基因(或基因编辑工具)导入人体,通过替代、补偿、阻断、修正特定基因以达到治疗疾病的目的。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体因其理化性质稳定、致病性弱、整合风险低、外源基因表达持久等结构和生物学方面的优势,已成为体内基因治疗领域研究、应用最为广泛的载体之一。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(六)

五、生产工艺通过前期的工艺开发和临床试验用药品的制备,应能建立并初步证明生产工艺的合理性和可重复性,拟定工艺应能稳定生产出符合预期质量的临床试验用药品。申报资料须明确临床试验用药品的生产厂和检验厂,提供基本的生产工艺信息,包括生产规模、工艺流程、具体的工艺参数、过程中控制信息、批次定义等。工艺开发信息应能支持临床试验用药品生产工艺设定的合理性,如质粒瞬转工艺中质粒的用量和配比、杆状病毒感染工艺中的病毒用量和比例、病毒收获条件、纯化工艺条件、制剂处方筛选等。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(三)

三、一般原则临床试验申报阶段,rAAV载体类产品可参考《中国药典》的相关要求(尤其是“人用基因治疗制品总论”的要求),结合申报阶段的特点,制定合理的药学研究计划和质量控制策略。临床试验用药品应按照“《药品生产质量管理规范(2010年修订)》临床试验用药品附录”(2022年第43号)的相关要求进行生产。临床试验用药品的研发、生产、使用和废弃处理应符合生物安全相关法律法规的要求。

西多福韦促进2型重组腺相关病毒体外转导分析

为研究小分子药物西多福韦(CDV)对2型重组腺相关病毒(rAAV2)体外转导效率的影响,采用不同剂量CDV干预rAAV2-GFP和rAAV2-LacZ载体转导Hela细胞,从转基因表达量、阳性细胞数量、胞内病毒基因组数等方面研究CDV对rAAV2转导的影响.结果表明,CDV能促进rAAV2体外转导Hela细胞,转基因表达量、阳性细胞数、胞内病毒基因组数与对照组相比,差异具有统计学意义,且其促进作用呈现一定的剂量和时间依赖性.

重组新城疫病毒rL-RVG抑制Nrf2-GCLC-GPX4通路诱导胃癌细胞铁死亡

目的探讨重组新城疫病毒(recombinant Newcastle disease virus,rL-RVG)是否通过Nrf2-GCLC-GPX4通路引发胃癌细胞铁死亡。方法培养人胃癌HGC-27细胞,分别用rL-RVG、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、PBS溶液(对照组)处理HGC-27细胞后,用CCK-8、Transwell侵袭、细胞划痕实验检测胃癌HGC-27细胞的增殖、侵袭、迁移能力。加入铁死亡促进剂(erastin)、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)促进剂(TBHQ)及抑制剂(ML385)作为干预组,脂质氧化试剂盒检测各组丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;DCFH-DA荧光探针及流式细胞仪检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量;Western blot、免疫荧光法检测Nrf2-GCLC-GPX4通路相关蛋白表达情况。结果与对照组比较,rL-RVG和NDV处理后,细胞的存活率均下降,呈剂量、时间依赖性,且rL-RVG处理组较为显著(P<0.05);NDV和rL-RVG处理组胃癌HGC-27细胞迁移、侵袭能力均受到抑制,后者较前者抑制更明显(P<0.05);与对照组比较,病毒组Nrf2、GCLC、SLC7A11、GPX4蛋白表达下降(P<0.05),MDA水平、ROS相对表达量上升(P<0.05),rL-RVG组上升或下降的趋势较NDV组明显,且erastin组SLC7A11、GPX4蛋白表达下降(P<0.05);与对照组比较,TBHQ组、ML385组Nrf2、GCLC、SLC7A11、GPX4蛋白表达分别上升、下降(P<0.05),MDA水平、ROS相对表达量分别下降、上升(P<0.05);与rL-RVG组比较,rL-RVG+TBHQ组、rL-RVG+ML385组Nrf2、GCLC、SLC7A11、GPX4蛋白表达分别上升、下降(P<0.05),MDA水平、ROS相对表达量分别下降、上升(P<0.05)。结论重组新城疫病毒(rL-RVG)可通过Nrf2-GCLC-GPX4通路诱导胃癌细胞铁死亡的发生,抑制肿瘤细胞的生长。

2型重组腺相关病毒介导的β-地中海贫血基因治疗实验

目的探讨2型重组腺相关病毒(rAAV2)能否有效转染重型β-地中海贫血患者造血细胞,通过体外途径基因治疗地中海贫血。方法 6只BALB/c裸小鼠分为转染组(n=4)和未转染组(n=2),经X射线照射后,分别移植入经rAAV2β-珠蛋白病毒转染(MOI=50)或未转染的β41-42/β654杂合子型重型β-地中海贫血流产胎儿造血细胞,转染后第28天和第70天分别处死rAAV2转染小鼠(n=2)和未转染受体小鼠(n=1)。采用RT-PCR、等位基因特异性PCR(ASPCR)法检测rAAV2介导的人β-珠蛋白基因在小鼠骨髓中的表达,并以高压液相色谱法量化分析受体小鼠外周血中人β-珠蛋白肽链的水平。结果①RT-PCR于所有受体小鼠样本中均可检测到人β-actin和人β-珠蛋白基因的表达。②ASPCR检测中,β41-42突变基因稳定表达于所有受体小鼠,β654突变基因仅在移植后第70天受体小鼠样本中被检测到;移植后第28天,rAAV2转染及未转染小鼠体内均可检测到主要来自于β654突变基因的正常β-珠蛋白基因表达;但至移植后第70天,仅rAAV2转染小鼠骨髓样本中仍可检测到rAAV2-β-globin载体介导的正常β-珠蛋白基因表达。③移植后第70天处死的转染小鼠外周血中人β链/α链分别为0.328和0.325,相对未转染组0.135的比值,两者的增加百分比高达144.78%和142.54%。结论经rAAV2介导基因修饰后的重型β-地中海贫血患者造血细胞在体内可长期稳定表达正常人β-珠蛋白基因,而其分化产生的外周血人红系细胞内β-珠蛋白肽链的合成增加。

2型重组腺相关病毒对人脐血CD34^+造血干/祖细胞的转导效率研究

为探讨 2型重组腺相关病毒 (rAAV 2 )载体能否有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,采用rAAV 2 /GFP感染经免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,在荧光显微镜下观察GFP的表达。结果显示 ,转导 19小时后感染复数 (MOI)为 2× 10 5时 ,CD34+细胞GFP基因的表达率为 4 3%。结论 :rAAV 2能有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞。

携带CIP2A shRNA重组腺相关病毒载体的构建及其鉴定

目的构建携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体,制备靶向性沉默CIP2A表达的高浓度重组腺相关病毒。方法设计合成CIP2AshRNA,退火形成双链与pDC316-EGFP-U6质粒BamHⅠ和HindⅢ双酶切产物相连接构建形成质粒pDC316-EGFP-CIP2AshRNA,以鉴定正确的pDC316-EGFP-CIP2AshRNA克隆为模板PCR扩增EGFPCIP2AshRNA片段,EcoRⅠ和SalⅠ双酶切PCR扩增产物及pSNAV2.0质粒后进行连接形成重组质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA,建立载体细胞株BHK/CIP2A-shRNA,采用AAV MaxTM包装系统大规模制备rAAV2-EGFPCIP2AshRNA并对其纯化及滴度测定。将rAAV2-EGFP-CIP2AshRNA感染肝癌细胞HepG2,利用空载病毒载体rAAV2-EGFP作对照,采用Real-time PCR及Western blot方法检测CIP2AshRNA基因沉默效果。结果携带编码CIP2AshRNA腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;将重组质粒与辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2共转染包装细胞BHK-21,成功制备重组腺相关病毒rAAV2-CIP2AshRNA,经测定纯化所得rAVV2病毒滴度为0.25×1012v.g./mL。筛选MOI值为1×105感染肝癌细胞HepG2,CIP2A mRNA及蛋白表达水平分别于感染后24h和48h与对照细胞相比出现明显下降。结论成功制备高滴度携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体rAAV2-CIP2AshRNA。

2型腺相关病毒重组绿色荧光蛋白对培养神经干细胞转染效率的研究

为探讨2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus2,rAAV-2)载体能否有效地转染神经干细胞(neural stem cell,NSC),本研究采用含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的rAAV-2(rAAV-2/EGFP),以感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为1×104、1×105、1×106转染体外培养大鼠胎鼠神经干细胞,在荧光显微镜下观察EGFP的表达。同时,检测子代细胞的活力、增殖倍数、分化情况,以评估rAAV-2对NSC存活、增殖、分化能力的影响。并利用流式细胞仪检测rAAV-2/EGFP对NSC的转染效率。结果显示,转染10d后各转染组可观察到NSC克隆球发出绿色荧光,起始荧光强度不一,同时荧光强度随时间的延长而逐渐增强。转染21d后荧光强度达高峰并维持在高水平。流式细胞仪检测结果表明:MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为26.34%、50.97%、56.36%,荧光指数(FI)分别为4.01、12.70、14.08。转染组和未转染组细胞培养7、14、21d时其细胞活力、增殖倍数、分化均无统计学差异。本实验初步证明rAAV-2能有效地转染NSC。

强力霉素诱导携带人血管内皮生长因子A-shRNA的1/2型重组腺相关病毒的包装及鉴定

目的通过Helper-Free腺相关病毒包装系统包装由强力霉素(doxycycline,DOX)诱导的携带hVEGFA-shRNA-GFP的1/2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV),测定病毒滴度并检测其对人视网膜血管内皮细胞(human ret-inal vascular endothelial cell,HRVEC)血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor,VEGFA)的敲除作用。方法将AAV-293细胞复苏、培养后传代。用磷酸钙转染法将质粒pAAV-hVEGFA-shRNA-GFP、1/2型腺相关病毒质粒(pAAV1/2)和pHelper质粒共转染AAV-293细胞,包装生成带有hVEGFA-shRNA-GFP的1/2型rAAV,将此rAAV感染AAV-293细胞,荧光显微镜观察病毒转染和感染效率。斑点杂交法测定病毒滴度。将HRVEC分为3组培养,正常对照组、HRVEC+rAAV组及HRVEC+rAAV+DOX诱导组,Western-blotting法检测VEGFA的敲除作用。结果 3种质粒共转染AAV-293细胞,发现病毒包装过程中细胞培养基颜色由红色变为橘黄色,细胞变圆并脱离培养皿底部,漂浮于培养基中。荧光显微镜下观察可见,24h后AAV-293细胞表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP),72h表达GFP细胞数比例可达95%～100%;共转染成功,包装得到DOX诱导的携带有hVEGFA-shRNA-GFP的1/2型rAAV,斑点杂交法检测病毒滴度为1015v.g.·L-1。HRVEC于重组病毒感染后第3天高表达GFP。免疫印迹法检测正常对照组、HRVEC+rAAV组及HRVEC+rAAV+DOX诱导组HRVEC中VEGFA表达量的变化发现:HRVEC+rAAV组其VEGFA表达量较正常对照组明显下降,HRVEC+rAAV+DOX诱导组其VEG-FA表达量较HRVEC+rAAV组明显降低。提示rAAV对细胞内VEGFA具有显著的敲除作用,并且DOX有加强VEGFA敲除的作用,病毒包装成功。结论 DOX诱导的携带有hVEGFA-shRNA-GFP的1/2型rAAV的包装获得成功,收获病毒具有较高滴度,能成功地感染HRVEC,并对HRVEC的VEGFA具有明显敲除作用,同时DOX有加强VEGFA敲除的作用,为眼底新生血管疾病基因治疗的研究提供了实验基础。

重组2型腺相关病毒-人骨形成蛋白7转染犬髓核细胞及其对髓核细胞表型的影响

目的:观察重组2型腺相关病毒-人骨形成蛋白7(recombinant adeno-associated virus-2expressinghuman bone morphogenetic protein-7,rAAV2-hBMP7)转染犬髓核细胞情况及其对细胞表型的影响。方法:用1岁龄Beagle犬L4/5椎间盘髓核进行髓核细胞体外培养,取第2代髓核细胞进行实验,实验组以rAAV2-hBMP7(1×105v.g/细胞)转染髓核细胞,对照组以重组2型腺相关病毒-增强型绿色荧光蛋白(recombinantadeno-associated virus-2expressing enhanced green fluorescent protein,rAAV2-EGFP)转染髓核细胞。在转染后4d、7d和14d以PCR检测髓核细胞中hBMP7的mRNA表达,在转染后7d和14d以Western blot法检测髓核细胞中hBMP7蛋白表达。在转染后4d、7d和14d采用RT-PCR法检测蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的mRNA含量,采用二甲基蓝及ELISA法分别检测蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的蛋白含量。结果:实验组髓核细胞表达hBMP7 mRNA及蛋白,并于转染后7d时表达量最高,而对照组无表达。实验组髓核细胞蛋白多糖mRNA及蛋白含量在转染后7d和14d时较4d时明显增高,14d时较7d时亦明显升高(P<0.05),对照组各时间点无统计学差异(P>0.05);4d时实验组与对照组比较无明显差异,7d和14d时较对照组明显增加(P<0.05)。同组各时间点Ⅰ型胶原mRNA及蛋白含量均无统计学差异,两组各时间点间比较无统计学差异(P>0.05)。实验组髓核细胞Ⅱ型胶原mRNA及蛋白含量在转染后7d和14d时较4d时明显增高,14d时较7d亦明显升高(P<0.05),对照组各时间点无统计学差异(P>0.05);实验组4d时与对照组比较无明显差异,7d和14d时较对照组明显增加(P<0.05)。结论:rAAV2-hBMP7转染犬髓核细胞后能表达hBMP7蛋白,并能提高其蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量。

NT4-Apoptin-HA2-TAT融合基因重组腺相关病毒的构建及鉴定

目的:构建编码融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT的重组腺相关病毒表达载体。方法:利用限制性内切酶切相应载体后将Apoptin和HA2-TAT连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT亚克隆至腺相关病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140共同转染HEK-293细胞,通过同源重组获得NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体,收集病毒上清,Dot blot法测定其滴度。MTT比色法观察NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒表达载体,对HepG2细胞存活率的影响。结果:经酶切及测序证实克隆出NT4-Apoptin-HA2-TAT融合基因;得到高滴度的(3.14×1015pfu/L)重组腺相关病毒表达载体。NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒表达载体,对HepG2细胞有强烈的诱导凋亡作用,与对照组比较,处理组细胞的存活率明显降低。结论:通过分子克隆体外重组技术成功制备了NT4-Ap-optin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体,为下一步的Apoptin应用于基因治疗奠定了基础。

重组腺相关病毒载体2型转染骨髓间充质干细胞的体外实验(英文)

背景:目前应用于基因治疗的病毒载体中,重组腺相关病毒载体2型载体与腺病毒和反转录病毒载体比较,由于其无致病性,引起学者们的关注。目的:观察体外重组腺相关病毒载体2型转染骨髓间充质干细胞,并用其作为携带基因表达的载体进行急性髓性白血病基因治疗的可能性。设计:开放性实验。单位:南方医科大学南方医院的血液科。材料:实验于2004-02/07在南方医科大学南方医院的血液科实验室完成。本实验所用的骨髓间充质干细胞来自急性髓性白血病6例初发患者和4名健康成年志愿者的第3～5代传代细胞。方法:从初发的急性髓性白血病患者和正常健康志愿者髂后上棘做骨髓穿刺抽取6～10mL肝素抗凝的骨髓,分离培养出间充质干细胞,用包含增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型感染间充质干细胞,将获取的骨髓间充质干细胞加入含一定感染复数(感染复数=1×102,1×103,1×104,1×105,1×106,1×107)的增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型病毒载体的不完全培养液,10～14d后在相差荧光显微镜下或用流式细胞仪观测绿色荧光蛋白的表达。在体外培养条件下观察绿色荧光蛋白在经过重组腺相关病毒载体2型转导的骨髓间充质干细胞中的表达。体外观察经增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型转导并被新霉素筛选后绿色荧光蛋白在被转导的骨髓间充质干细胞中的表达。通过相差荧光显微镜下确证绿色荧光蛋白表达后,在BD流式细胞仪上检测绿色荧光蛋白的表达。主要观察指标:①增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型对骨髓间充质干细胞的转染率分析。②在转染后的不同时间点用相差荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果:①转染率分析:增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型对来源于健康志愿者和急性髓性白血病患者的骨髓间充质干细胞的转染率均不高,转染率在0.3%～1.4%。转染后10～14d绿色荧光蛋白开始表达,一般感染条件绿色荧光蛋白阳性骨髓间充质干细胞所占比例为(1.030±0.034)%,重复3轮感染条件下为(1.140±0.036)%,脂质体协助感染条件下为(1.380±0.054)%,改变转染条件(包括重复感染,延长感染时间,增加感染复数,脂质体协助转染)亦不能明显增加转染率(P>0.05),而增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型却能高效的转染其包装细胞293细胞。②绿色荧光蛋白在体外长期稳定表达分析:实验观察61d内,绿色荧光蛋白保持低水平长期稳定表达,在转染后的12～33d,绿色荧光蛋白阳性的骨髓间充质干细胞从起始时的1.16%下降到0.5%～0.6%,33～61d一直维持在这一水平;经过新霉素筛选30d后,表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞达到6.6%左右,在体外继续传代培养,在体外观察的100d中,表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞一直维持在6%的水平。结论:重组腺相关病毒载体2型介导的基因转导的优势是安全、无免疫反应,目的基因能够长期稳定表达。重组腺相关病毒载体和骨髓间充质干细胞可用于体外基因治疗,其将来可能成为全身基因治疗的良好载体。

氧化应激促进重组腺相关病毒2型体外转导分析

为揭示氧化应激在重组腺相关病毒2型(rAAV2)转导中的作用,以过氧化氢(H_(2)O_(2))和铁过载(Fe-NTA)氧化应激为模型,在293T,LO-2,Hela,A549细胞中,从转基因表达量、阳性细胞数、基因组数和病毒衣壳分布等方面研究氧化应激对rAAV2转导的影响.实验结果表明:H_(2)O_(2)和Fe-NTA能促进rAAV2转导,转基因表达量、阳性细胞数、基因组数与对照组相比的差异具有显著的统计学意义;细胞转导12 h后,氧化应激组核周围衣壳分布数目显著比对照组多,氧化应激能够促使rAAV2长时间聚集在细胞核周围;当氧化应激产生的活性氧(ROS)被N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)消除,则氧化应激促rAAV2转导作用消失,说明氧化应激通过ROS发挥促进rAAV2转导作用.

Her2/neu基因重组腺相关病毒转染人外周血来源树突状细胞的免疫功能

目的Her2/neu基因重组腺相关病毒(rAAV-Her2/neu)转染人外周血树突状细胞(DC),并检测其免疫功能。方法采用Ficoll分离健康人外周血中的单个核细胞。将其分成两组,给其中一组加入病毒。应用含10%人AB血清的RPMI-1640培养基及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介-4、肿瘤坏死因子-α培养。第7天收获成熟DC。流式细胞仪检测DC表型。3H-TdR检测同种混合淋巴细胞反应。MTT法检测DC诱导T细胞的杀伤活性。结果加病毒组CD1a、CD86和CD83分别为:98.10%、99.42%、84.59%;无病毒组为:92.69%、98.07%、82.72%,组差别不明显。加病毒组CD40、CD80分别为:61.02%、97.61%;无病毒组为:36.19%、55.5%,加病毒组高于无病毒组。两组均能刺激T淋巴细胞增殖。加病毒组DC可诱导特异性杀伤,最高杀伤率(39.7±7.2)%。结论rAAV-Her2/neu转染的DC有更强的免疫功能。

结肠灌注重组腺相关病毒2/人凝血因子Ⅸ基因载体治疗血友病B的安全性研究

目的分析结肠灌注重组腺相关病毒2/人凝血因子Ⅸ(rAAV2/CMV-hFⅨ)基因载体治疗血友病B小鼠的安全性。方法将rAAV2/CMV-hFⅨ(剂量为1×1013 v.g/kg)结肠灌注血友病B模型小鼠,分别检测抗重组腺相关病毒2(rAAV2)抗体和抗人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)抗体,并通过组织病理学、免疫组化和PCR技术分析病毒和hFⅨ的组织分布。结果灌注后,在小鼠体内能够检测到抗rAAV2抗体和抗hFⅨ抗体;组织病理学、免疫组化和PCR技术分析结果显示灌注部位肠组织无明显病理改变,rAAV2以及hFⅨ基因仅仅在灌注的肠上皮。结论结肠灌注重组腺相关病毒基因治疗血友病B小鼠,在所观测时间内是安全的。

重组腺相关病毒为载体的心肌肌浆网钙离子ATP酶2a基因转导治疗慢性充血性心力衰竭:短期及中期作用(英文)

背景:慢性充血性心力衰竭(CHF)时,心肌肌浆网钙离子ATP酶2a(sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase,SERCA2a)的蛋白表达和活性均明显降低,这导致钙离子的调控异常和心脏收缩和舒张功能不全。目的:观察腺相关病毒为载体的SERCA2a基因转导对CHF大鼠的短期和中长期治疗作用,探讨其治疗心力衰竭的多种可能的机制。设计:随机对照设计。单位:解放军总医院老年心内科和病理生理研究室。方法:将雄性SD大鼠随机分为,假手术组,CHF组,CHF+GFP组和CHF+SERCA2a组4组,每组又分为基因转导10,30d2个时间点,后3组采用腹主动脉缩窄术建立CHF大鼠模型,手术后18～20周,造模成功的大鼠进行经腹心包腔内注射,CHF组注射500μL无菌生理盐水,CHF+GFP组和CHF+SERCA2a组分别注射等量携带GFP基因和SERCA2a基因的重组腺相关病毒。主要观察指标:①于基因转导后10,30d,检测大鼠的血流动力学参数,应用WesternBlot方法检测SERCA2a蛋白表达;改良的Jones法测定SERCA2a活性。②应用蛋白质组学研究技术分析比较基因转导30d组中CHF和CHF+SERCA2a亚组大鼠的心肌蛋白质组表达的差异。③应用电泳分离和定量的方法检测基因转导30d组的各亚组大鼠心肌肌球蛋白重链亚型的表达情况。结果:①SERCA2a蛋白表达和活性:CHF组和CHF+GFP组低于假手术组。基因转导10d后,CHF+SERCA2a组与CHF组比较,SERCA2a蛋白表达增加80.7%,活性增加89.9%,但低于假手术组水平;基因转导30d后,CHF+SERCA2a组SERCA2a蛋白表达和活性已经达到假手术组大鼠水平。②心脏功能:基因转导10d后,CHF+SERCA2a组血流动力学指标中左室舒张末压力明显下降,其他指标明显升高,但未完全达到对照大鼠的心功能水平;基因转导30d后心脏收缩和舒张功能进一步改善,各项指标与假手术组比较差异不显著。③心肌蛋白质组的研究发现,基因转导30d后,CHF+SERCA2a组多种能量代谢的酶表达明显增加。④凝胶电泳发现:CHF时α-MHC的表达明显降低而β-MHC则显著增加,α-MHC/β-MHC明显低于假手术组大鼠;基因转导30d后,α-MHC、β-MHC的表达以及α-MHC/β-MHC恢复至假手术组大鼠水平。结论:以重组腺相关病毒2作为载体,SERCA2a基因转导可以增强衰竭心脏的SERCA2a功能,纠正Ca2+稳态异常,增加心脏能量代谢,纠正MHC亚型的异常表达,增强心脏收缩和舒张功能;因而SERCA2a基因转导对CHF具有良好的短期和中长期治疗作用。