重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(二)

二、适用范围本指导原则中的rAAV载体是指基于腺相关病毒的结构和理化特性,经设计和重组改造所形成的用于携带外源目的基因(或核酸片段)的病毒载体。本指导原则主要针对应用于体内基因治疗的rAAV载体类产品在申报临床试验时应完成和提交的药学研究信息提出建议。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(七)

六、质量研究与质量标准1.质量研究rAAV载体类产品的质量研究应根据产品的设计、作用机制和生产工艺等方面确定,一般包括(但不限于):鉴别、结构分析、一般理化特性、含量、纯度、生物学活性、杂质、污染物检测等。研究样品应具有代表性,如工艺相近或相同的非临床研究用样品、临床试验用药品等。质量研究信息应完整,包括分析方法原理介绍、研究样品、试验条件和基本步骤、数据处理和结果分析等,分析方法应能满足预期用途。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(一)

一、前言体内基因治疗产品一般选用适当的载体或转染方式将外源基因(或基因编辑工具)导入人体,通过替代、补偿、阻断、修正特定基因以达到治疗疾病的目的。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体因其理化性质稳定、致病性弱、整合风险低、外源基因表达持久等结构和生物学方面的优势,已成为体内基因治疗领域研究、应用最为广泛的载体之一。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(六)

五、生产工艺通过前期的工艺开发和临床试验用药品的制备,应能建立并初步证明生产工艺的合理性和可重复性,拟定工艺应能稳定生产出符合预期质量的临床试验用药品。申报资料须明确临床试验用药品的生产厂和检验厂,提供基本的生产工艺信息,包括生产规模、工艺流程、具体的工艺参数、过程中控制信息、批次定义等。工艺开发信息应能支持临床试验用药品生产工艺设定的合理性,如质粒瞬转工艺中质粒的用量和配比、杆状病毒感染工艺中的病毒用量和比例、病毒收获条件、纯化工艺条件、制剂处方筛选等。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(三)

三、一般原则临床试验申报阶段,rAAV载体类产品可参考《中国药典》的相关要求(尤其是“人用基因治疗制品总论”的要求),结合申报阶段的特点,制定合理的药学研究计划和质量控制策略。临床试验用药品应按照“《药品生产质量管理规范(2010年修订)》临床试验用药品附录”(2022年第43号)的相关要求进行生产。临床试验用药品的研发、生产、使用和废弃处理应符合生物安全相关法律法规的要求。

腺相关病毒感染GDF11对2型糖尿病大鼠血管损伤的保护作用

目的探讨腺相关病毒感染上调体内生长和分化因子11(GDF11)表达水平对2型糖尿病大鼠(T2DM)主动脉损伤的影响。方法随机选取9周龄雄性SD大鼠,采用高糖高脂饲料加小剂量链脲佐菌素(STZ)联合诱导,建立T2DM模型。正常大鼠和糖尿病模型大鼠随机分为5组:空白对照组(Control组)、阴性病毒对照组(NC组)、GDF11腺相关病毒组(GDF11组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病+GDF11腺相关病毒组(DM+GDF11组)。喂养8周后,检测大鼠血清中胰岛素(INS)、晚期糖基化终末产物(AGES)、重组生长转化因子11(GDF11)、总胆固醇(T-CHO)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、不对称二甲基精氨酸(ADMA)、丙二醛(MDA)浓度;采用过碘酸雪夫氏染色(PAS染色)观察糖原沉积部位,苏木精-伊红染色(HE)观察血管损伤情况,扫描电镜观察血管内皮细胞和血管弹性纤维损伤情况,蛋白印迹和免疫组化检测血管损伤相关蛋白的表达水平。结果在动物实验中与Control组相比,生化指标提示:DM组大鼠血清中AGES、T-CHO、TG、LDL-C和MDA浓度升高(P<0.05),INS、GDF11、HDL-C、ADMA显著低于Control组(P<0.05),DM+GDF11组AGES和HDL-C与DM组无明显差异,T-CHO、TG、LDL-C和MDA相比较DM组降低(P<0.05),INS、GDF11和ADMA相比较DM组升高(P<0.05)。病理染色提示:DM组PAS染色提示糖原颗粒在主动脉内皮及内皮下沉积,HE染色观察到主动脉中膜增厚,内皮细胞及弹性纤维断裂走形不规则,电镜观察到DM组血管内皮损伤,弹性纤维断裂,DM+GDF11组这些变化有所减轻。蛋白印迹和免疫组化表示内皮细胞相关蛋白在DM组中表达下降(P<0.05),间充质标志物在DM组中表达升高(P<0.05),DM+GDF11组中这些蛋白有所回调,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论提高体内GDF11表达水平可以改善糖尿病导致的主动脉血管损伤,推断可能与其抑制内皮间充质转化保护血管内皮细胞的功能从而改善血管损伤有关。

人白介素10重组腺相关病毒血清型2/1杂合载体的构建及转导供肝的效果

目的:构建含人白介素10(hIL-10)的腺相关病毒血清型2/1杂合载体(AAV2/1),并观察其在供肝移植物中的表达.方法:采用RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增hIL-10cDNA,将其克隆对pMD18-T载体中,测序后,再经酶切定向插入真核表达载体pSNAV,用脂质体介导转染BHK21细胞,经G418筛选得到含ITR—hIL-10-ITR的BHK21细胞株,用携带rep2-cap1基因的辅助病毒(rHSV/r2c1)感染该细胞株.通过细胞孵育、裂解和病毒纯化,得到含hIL-10的AAV2/1载体.在供肝灌洗、保存中应用该重组病毒载体转染供肝移植物,移植后检测其在移植物中的表达.结果:RT-PCR扩增的hIL-10cDNA序列与GenBank中hIL-10cDNA序列一致,构建了rAAV2/1-hIL-10表达载体.转染供肝移植物后可检测到hIL-10,持续24wk表达.移植后24wk,实验组供肝中hIL-10的表达比空白对照组和rAAV2/1-GFP对照组显著增高(219.15±45.83ng/Lvs40.02,38.64ng/L,P<0.05).结论:成功构建了rAAV2/1-hIL-10表达载体系统,并在大鼠供肝中持续表达hIL-10,为IL-10在器官移植中的生物学作用机制及临床应用的深入研究奠定基础.

9型重组腺相关病毒转染体外培养大鼠心肌细胞的影响

目的:研究含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的9型重组腺相关病毒(rAAV9)对大鼠心肌H9C2细胞的转染及对细胞生长的影响。方法:rAAV9-EGFP按转染复数(MOI)1×105、1×106、1×107转染H9C2细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察H9C2细胞中EGFP阳性表达情况,采用流式细胞仪检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞的转染效率。观察转染后细胞生长形态,并用AlamarBlue法检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞增殖影响。结果:转染后第1天,MOI=1×106、1×107组中EGFP开始表达;第2天,MOI=1×105组开始表达,各组EGFP表达强度随MOI值的增高而增强,同时EGFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强;转染后第4天达到高峰,此时流式细胞术检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞的转染率分别为MOI=1×105组:(14.1±0.2)%、MOI=1×106组:(35.1±4.8)%、MOI=1×107组:(56.8±0.1)%。rAAV9-EGFP转染H9C2细胞后,细胞生长及形态正常,AlamarBlue法进一步检测表明转染组对H9C2细胞增殖无影响。结论:rAAV9-EGFP能够有效地转染H9C2细胞,且rAAV9-EGFP对H9C2细胞增殖无明显抑制。

不同血清型腺相关病毒载体组织表达差异的研究进展

重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)具有弱免疫源性、可介导治疗基因长期稳定表达等优势,使其被公认为基因治疗的理想载体之一。目前临床研究广泛采用的AAV-2血清型载体对部分靶器官和组织的转导效率不十分理想,同时AAV-2中和抗体会干扰此型载体介导的基因转移效率。为了克服上述不足,众多学者将开展了针对其他7种天然血清型AAV(AAV-1,AAV-3至AAV-8)的研究。研究表明这些新型载体的组织亲嗜性和针对同一靶器官的转导效率与AAV-2不同,并且规避了AAV-2免疫应答对载体介导基因转移效率的影响。在视网膜中AAV-1、AAV-5的表达检出较早,表达水平高于AAV-2;AAV-5在胰腺的表达水平也明显高于AAV-2;AAV-4,AAV-5在中枢神经系统的转导效率和表达水平均显著高于AAV-2,并且表达不仅局限于注射部位;AAV-1,3,4,5,7型载体在肌肉的表达水平均超过AAV-2,其中又以AAV-1最为显著;肺组织中AAV-1,5,6型的表达较高,其中AAV-5表达量又高于AAV-1和AAV-6;而肝脏表达水平由高到低的先后顺序为AAV-1>AAV-5>AAV-3>AAV-2。这些研究均提示了新型AAV载体在基因治疗研究和应用领域的巨大潜力。

NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因重组腺相关病毒载体的构建及鉴定

目的:设计构建融合基因NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的重组腺相关病毒表达载体。方法:应用非对称引物/模板法,PCR技术制备Ant-Shepherdin[79-87]cDNA片段,通过连接pGEM-T-Easy载体及PBV220-NT4质粒,转化感受态细胞,获得NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因,连接腺相关病毒穿梭质粒pSSHG-CMV,采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染HEK-293细胞获取重组腺相关病毒,Dot-blot法测定重组病毒滴度,MTT比色法观察重组腺相关病毒对A549细胞存活率的影响。结果:合成Ant-Shepherdin[79-87]基因,连接PBV220-NT4,经克隆、酶切,琼脂糖凝胶电泳证实获得321bp的NT4-Ant-Shepherdin[79-87]目的基因;得到高滴度的(3.4×1013pfu/L)重组腺相关病毒表达载体;带有融合基因NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的重组腺相关病毒对A549细胞具有强烈的诱导凋亡作用。结论:成功构建了NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因的重组腺相关病毒表达载体,为进一步研究针对Survivin的靶向抗肿瘤作用奠定了基础。

重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9的构建及其对体外培养的大鼠耳蜗组织的转染

目的:包装携载神经营养素(NT4)与活性依赖性神经营养因子-9(ADNF-9)融合基因的重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9,并观察该重组病毒对体外培养的耳蜗组织的转染。方法:使用pSSHG-CMV-NT4-ADNF-9,pGF140和pAAV/Ad 3种质粒共转染293包装细胞,制备ADNF-9重组腺相关病毒(recomb inate adeno-assoc iated virus,rAAV),应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度;体外分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞;将重组病毒感染体外培养的新生SD大鼠耳蜗毛细胞,于24 h后提取组织行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以检测rAAV-NT4-ADNF-9对耳蜗的转染。结果:应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度为2×1013cfu/m l,表明成功地构建了重组AAV载体。成功分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞后,经RT-PCR反应,琼脂糖凝胶电泳检测结果显示NT4-ADNF-9在耳蜗组织得到了表达。结论:构建的重组病毒rAAV-NT4-ADNF-9,在体外可成功转染耳蜗组织,用于基因治疗的研究。

表达Kallistatin的9型重组腺相关病毒的制备及其体外表达效率

采用三质粒磷酸钙共转染生产系统,制备出可以表达内源性抗肿瘤血管生成因子(Kallistatin)的9型重组腺相关病毒(rAAV2/9)和2型重组腺相关病毒(rAAV2/2).rAAV经银染法鉴定其纯度;采用WesternBlotting法比较rAAV2/9和rAAV2/2外壳蛋白的大小;qPCR方法检测rAAV的滴度.使用rAAV2/9-Kal-listatin和rAAV2/2-Kallistatin分别感染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)后,RT-PCR和ELISA法分别检测Kallistatin的mRNA和蛋白表达水平.结果表明:纯化的病毒纯度达到98%以上;rAAV9外壳蛋白比rAAV2的大.感染HUVEC后,rAAV2/9介导Kallistatin在mRNA和蛋白表达水平都要比rAAV2/2高.

重组腺相关病毒基因药物临床前评价方法的回顾与展望

重组腺相关病毒(rAAV)基因药物在临床应用过程中长期疗效不确定,甚至存在安全性风险,是制约其广泛应用的主要障碍.对现有rAAV基因药物临床前评价方法进行分析和梳理.结果表明:仅进行药效学评价不能揭示rAAV转导的细胞和分子机制,而基于转导过程分析的物理转导与功能转导评价存在结果不一致,不能反映rAAV转导的细胞异质性和靶细胞的空间分布特征等问题,难以准确预测rAAV基因药物的临床疗效和安全性,需要从单分子、单细胞水平开展rAAV载体胞内命运评价的新方法,以切实保障新型rAAV基因药物的临床有效性和安全性.

西多福韦促进2型重组腺相关病毒体外转导分析

为研究小分子药物西多福韦(CDV)对2型重组腺相关病毒(rAAV2)体外转导效率的影响,采用不同剂量CDV干预rAAV2-GFP和rAAV2-LacZ载体转导Hela细胞,从转基因表达量、阳性细胞数量、胞内病毒基因组数等方面研究CDV对rAAV2转导的影响.结果表明,CDV能促进rAAV2体外转导Hela细胞,转基因表达量、阳性细胞数、胞内病毒基因组数与对照组相比,差异具有统计学意义,且其促进作用呈现一定的剂量和时间依赖性.

不同血清型腺相关病毒在中枢神经系统转导效率研究进展

腺相关病毒(AAV)能感染非分裂期的细胞,对宿主几无致病性及能使宿主长期稳定的表达外源基因,是神经系统疾病基因治疗的常用载体。不同血清型的AAV,由于分子结构与细胞结合机制的差异,在组织细胞中常表现出不同的转导效率。为了寻求更有效的中枢神经系统疾病基因治疗的方法,有必要对各型AAV在神经系统组织细胞内的转导特性进行深入的研究。

9型重组腺相关病毒转染microRNA-21前体在大鼠心肌的转染效率及安全性

目的研究含荧光标记ZsGreen的9型重组腺相关病毒(rAAV9)转染目的基因microRNA-21前体(pre-miR-21)至大鼠心肌的转染效率、表达时间及安全性。方法用冠脉注射方法转染PBS及rAAV9-Zs-Green-pre-miR-21 1.0×1010vg/只、1.0×1011vg/只、1.0×1012vg/只至SD大鼠心肌,倒置荧光显微镜观察心肌组织荧光表达并计算转染效率,Realtime PCR方法测定miR-21表达,超声心动图观察大鼠心功能。结果冠脉注射后7 d PBS组未见绿色荧光,余各组大鼠心肌均可观察到少量绿色荧光表达,第14天达高峰,之后呈下降趋势。14 d高病毒量组较其他中、低病毒量组转染效率明显高([73.7±8.4)%vs(39.6±4.8)%,(P<0.001)];([73.7±8.4)%vs(24.1±4.2)%,(P<0.001)]。14 d miR-21表达在低、中、高病毒量组较PBS组分别增加1.51倍、2.89倍及4.43倍。rAAV9转染后对大鼠心功能无影响(P>0.05)。结论 rAAV9-Zs-Green-pre-miR-21可以有效、持久、安全地在大鼠心肌表达。

重组腺相关病毒(rAAV)介导基因SMCKA3999对Duchenne肌营养不良病理和功能的影响

目的 研究重组腺相关病毒 (rAAV)载体介导的dystrophin小基因SMCKA3999治疗DMD模型鼠mdx ,从病理和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效。方法 以dystrophin小基因SMCK A3999为目的基因 ,将SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAVSMCKA3999,以 5× 10 10 病毒颗粒单点注射于DMD模型鼠mdx腓肠肌 ,基因治疗后 4个月及 7个月 ,采用免疫荧光、光镜组织病理、肌电图等方法 ,从形态和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效。 结果 rAAVSMCKA3999使肌膜缺失的dys trophin恢复并稳定表达持续 7个月以上 ,肌肉组织病理改变好转 ,肌病肌电图改变明显改善 ,疗效持续 4个月以上。 结论 rAAVSMCKA3999能改善mdx小鼠骨骼肌的病理及功能 ,采用rAAV介导的dystrophin小基因SMC KA3999对Duchenne肌营养不良基因治疗是有希望的治疗方法。

构建重组人SERCA2a基因9型腺相关病毒载体和病毒包装

目的探讨构建重组人SERCA2a基因9型腺相关病毒载体和病毒包装的方法,并包装出rAAV9-hSERCA2a-EGFP。方法根据细菌内同源重组的方法使用腺相关病毒包装系统,将hSERCA2a基因克隆到腺相关病毒载体中,与腺相关病毒包装质粒pAAV pHelper发生重组,通过脂质体共转染人胚肾293(HEK293)细胞,产生重组腺相关病毒,通过酶切鉴定和DNA测序鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定(采用荧光滴度检测法)。结果酶切鉴定和DNA测序证明重组腺相关病毒载体rAAV9-hSERCA2a-EGFP构建成功,PCR鉴定可见到阳性扩增条带,rAAV9-hSERCA2a-EGFP滴度高达1×1012 vg(virus genomes,vg)/mL。结论本方法成功构建和包装滴度为1×1012 vg/mL携带hSERCA2a基因的rAAV9-hSERCA2a-EGFP。

腺相关病毒载体血清型8递送的大鼠FVⅢ轻链对不同长度人FVⅢ重链活性的促进作用

目的:研究大鼠FVⅢ轻链(rL C)对不同长度人FVⅢ重链(hHC,包括hHC745和hHC1690)活性的影响。方法:将hHC745、hHC1690、人FVⅢ轻链(hLC)和rL C分别克隆至含CB启动子的腺相关病毒血清型8(AAV8)表达载体中,采用HC和LC共表达的双链策略,转染293T细胞,收取转染后48 h的细胞培养上清;质粒经尾静脉高压注入血友病A(HA)小鼠,注射后48 h通过眼眶采血收集小鼠的外周血血浆。应用活化部分凝血活酶时间(aPTT)法检测FVⅢ的活性,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测FVⅢ的抗原表达量,计算比活性。结果:在293T细胞中,hHC745和hHC1690与rL C共表达时的FVⅢ活性显著高于与hLC共表达时的活性,分别提高到约4.6倍和2.9倍;ELISA结果表明hHC745和hHC1690与hLC和rL C共表达时的FVⅢ抗原表达无统计学差异;根据aPTT测得的FVⅢ活性与ELISA测得的FVⅢ抗原表达量计算的比活性结果显示,hHC745与rL C共表达时的比活性提高到与hLC共表达时的比活性的约4.1倍,而hHC1690与rL C共表达时的比活性提高到与hLC共表达时的约2.8倍。在高压注射的HA小鼠中,hHC745和hHC1690与rL C共表达时的FVⅢ活性显著高于与hLC共表达时的活性,活性分别提高到约5.1倍和2.1倍;ELISA结果同样显示,hHC745和hHC1690与hLC和rL C共表达时FVⅢ抗原表达无统计学差异;比活性结果表明,hHC745和hHC1690与rL C共表达时的比活性较与hLC共表达时的比活性显著提高,分别提高到约4.2倍和1.8倍;hHC1690与rL C共表达时的FVⅢ活性显著高于hHC745与rL C共表达时的活性。结论:rL C可以显著提高不同长度hF VⅢ重链(hHC745和hHC1690)的活性。