重组枯草芽孢杆菌产角蛋白酶的发酵培养基及发酵条件优化

角蛋白是潜在的优良饲用蛋白资源,其中角蛋白酶作为可特异性降解角蛋白的酶类,在角蛋白饲料化领域展现出广泛的应用潜力和价值。本研究以自主构建的重组角蛋白酶工程菌枯草芽孢杆菌WB600-pMA5-kerJY-23为研究对象,利用单因素和二次通用旋转组合设计试验对其摇瓶发酵产角蛋白酶的发酵培养基和发酵条件进行优化。结果表明:该菌株最佳发酵产酶条件为:葡萄糖25 g/L,蔗糖25 g/L,酵母浸膏20 g/L,硫酸铵10 g/L,磷酸氢二钾1.5 g/L,氯化钠0.3 g/L,氯化钙0.025 g/L,硫酸镁0.025 g/L,硫酸亚铁0.015 g/L,氯化锰0.05 g/L,初始pH 8,装液量45 mL/250 mL三角瓶,接种量6%,培养温度37℃,摇床转速200 r/min,发酵周期36 h。在该优化条件下,重组枯草芽孢杆菌WB600发酵产角蛋白酶的酶活达到(2110±15.011)U/mL,较优化前提高了5.10倍(P<0.05),为该酶在角蛋白降解及资源化利用领域的应用提供了理论依据与研究基础。

重组枯草芽孢杆菌表达4-木糖醇脱氢酶的发酵和反应条件优化

L-木酮糖(L-苏式-戊酮糖)是一种昂贵的稀有戊糖,而4-木糖醇脱氢酶(xylitol-4-dehydrogenase,XDH)是生物合成L-木酮糖(L-xylulose)的关键酶。为了促进L-木酮糖的生产,对枯草芽孢杆菌外源表达4-木糖醇脱氢酶的发酵条件进行优化,并对以木糖醇为底物静息细胞催化反应合成L-木酮糖的反应条件进行研究。通过单因素实验确定了最佳培养基的成分(g/L)为:蔗糖25,尿素6,MgSO_40. 05,MnSO_40. 01,FeSO_40. 01,初始pH值8. 0。最佳发酵条件为:装液量40 mL(250 mL锥形瓶),接种量1. 67%,发酵培养温度28℃。在优化条件下4-木糖醇脱氢酶酶活为5. 183 U/L,与初始酶活相比提高了231. 2%。最优反应条件:底物质量浓度20 g/L,50mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH 10. 0),反应温度45℃,优化反应条件下转化率达到17. 74%。通过对菌株发酵和反应工艺条件的优化,为后续L-木酮糖工业化生产奠定了基础。

重组巨大芽孢杆菌在小麦根际的定殖及其对植物真菌病害的防治效果

对含有外源几丁质酶编码基因的重组菌株———巨大芽孢杆菌B13011和B13012进行了小麦根际定殖能力,平板抑真菌能力和盆栽防病试验。两重组菌株均能在小麦根际及根内成功定殖;在盆栽条件下,对小麦全蚀病、小麦纹枯病、棉花立枯病、棉花枯萎病四种真菌病害的防效与受体菌B1301相比达显著性差异(P=0.05,LSR测验),其中B13011对纹枯病的防治效果达到了81 61%。两重组菌株均能提高受试作物的生物量,其中B13011提高棉花的生物量达39 40%。

重组巨大芽孢杆菌产青霉素G酰化酶发酵条件研究

对重组巨大芽孢杆菌产胞外青霉素G酰化酶的发酵条件进行优化。先用单因素实验确定最适碳源、氮源以及碳源浓度、氮源浓度、发酵时间和发酵温度的范围。采用Box-Behnken实验设计和响应面分析方法,对重组巨大芽孢杆菌产青霉素G酰化酶的发酵条件进行优化,得出其最佳发酵条件为:葡萄糖32 g/L、胰蛋白胨17 g/L、时间42.5 h、温度34℃,在此条件下青霉素G酰化酶的活力达到10 614±8 U/L,较优化前提高了16.83%。

重组枯草芽孢杆菌的构建及对甾体的C_(1，2)位脱氢

本文将简单节杆茵3-甾酮-1-脱氢酶基因克隆到分泌表达载体pWB980上,并转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到重组芽孢杆菌菌株。重组芽孢杆菌表达出的目的蛋白的分子量为55KDa,分光光度法检测到胞内和胞外可溶性部分的酶活分别为110±0．5mU和15±0．6mU每毫克蛋白,对甾体底物4-AD的转化率为45．3%,比出发茵简单节杆菌提高了将近10倍。

重组枯草芽孢杆菌SE1对肉鸡生长性能、肠道消化酶活性和菌群的影响

本试验旨在研究芽孢表面展示鸡白痢沙门氏菌Omp C重组枯草芽孢杆菌SE1对肉鸡生长性能、肠道消化酶活性和菌群的影响。选择7日龄肉鸡120只,随机分为3组,每组4个重复,每个重复10只鸡。A组(对照组)饲喂基础饲粮,B组和C组分别在基础饲粮中添加0.1%(1.0×106CFU/g)枯草芽孢杆菌168制剂和0.1%(1.0×10~6CFU/g)重组枯草芽孢杆菌SE1制剂,试验期35 d。结果显示:1)与A组相比,C组肉鸡的终末体重和平均增重分别增加6.14%和6.76%(P>0.05),料重比降低8.21%(P>0.05)。2)28、42日龄时,B组和C组肉鸡的空肠脂肪酶和回肠蛋白酶活性显著高于A组(P<0.05);B组和C组肉鸡的肠道消化酶活性无显著差异(P>0.05)。3)28、42日龄时,B组和C组肉鸡的回肠、盲肠大肠杆菌数量显著低于A组(P<0.05),盲肠乳杆菌数量显著高于A组(P<0.05)。16S rRNA V3区聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)结果显示,B组和C组肉鸡的盲肠菌群丰富度、均匀度和香农-维纳指数均显著高于A组(P<0.05);C组肉鸡盲肠菌群的相似性在28、42日龄时分别比A组高26.8%和15.6%,C组和B组之间无显著差异(P>0.05)。结果表明,重组枯草芽孢杆菌SE1具有与枯草芽孢杆菌168相同的效果,能有效促进肉鸡生长,提高肠道脂肪酶和蛋白酶活性,调节肉鸡肠道菌群,提高肠道菌群稳定性和多样性。

表达谷氨酸脱羧酶重组枯草芽孢杆菌的构建及其发酵条件的优化

谷氨酸脱羧酶(GAD)是生物合成γ-氨基丁酸(GABA)的关键酶,本研究通过基因工程构建了一株产GAD的重组枯草芽孢杆菌,并对其产GAD的发酵条件进行优化。分别通过单因素法、正交实验、极差分析和响应面法确定了最佳培养基成分(g/L)及发酵条件为:蔗糖23.5,豆粕10、乙酸铵为8.5、磷酸二氢钾4.1、七水硫酸镁0.5,p H7.0,培养温度37℃。在优化条件下GAD酶活达到0.413 U/m L,与优化前的GAD酶活0.143 U/m L相比,酶活提高了188.8%。本研究有助于后续开发枯草杆菌生产γ-氨基丁酸的工艺,以克服现在γ-氨基丁酸生产工艺中,大肠杆菌安全性的问题和乳酸菌成本过高的问题。

产碱性淀粉酶重组枯草芽孢杆菌的构建与发酵优化

碱性淀粉酶催化淀粉在碱性环境中高效降解,广泛应用于纺织退浆、洗涤、制药等领域。通过信号肽筛选,将来源于嗜碱单胞菌Alkalimonas amylolytica的碱性淀粉酶基因于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600实现分泌表达,并优化了重组菌产酶的发酵条件。在最佳信号肽ywb N介导下,重组B.subtilis发酵51 h,胞外Amy K酶活最高达146.86 U/m L,且能在发酵上清液中检测到与Amy K理论相对分子质量(60 k Da)一致的蛋白质条带。通过单因素实验优化了发酵培养基(糊精32 g/L,蛋白胨12 g/L,酵母粉24 g/L,KH_2PO_42.32 g/L,K2HPO_4·3H_2O 16.43 g/L),并在发酵24 h后添加0.2 g/d L Na_2CO_3调节发酵液p H,发酵72 h胞外Amy K酶活达640.33 U/m L,较优化前提高了336%,是目前已报道重组B.subtilis产碱性淀粉酶的最高水平。研究结果为Amy K发酵生产的工业化提供了数据支撑。

重组枯草芽孢杆菌发酵产青霉素G酰化酶的条件优化

【目的】研究提高PGA酶活力及稳定性.【方法】以重组枯草芽孢杆菌10397(pMA5-PGA)产PGA酶活力为研究对象,在单因素试验基础上,采用响应面设计,对重组菌发酵产PGA的培养基及发酵条件进行了研究.【结果】以葡萄糖20.39g/L、胰蛋白胨15.48g/L、糊精6.1g/L为培养基,在三角瓶装液量16.23%、接种量4.32%、温度35.43℃、时间48.34h、摇床转速220r/min的条件下,所产PGA的酶活力为14.167U/mL,比初始发酵条件下发酵重组菌产PGA的酶活提高了1.14倍.【结论】通过条件优化,可提高重组枯草芽孢杆菌PGA的酶活力,并为工业化生产PGA提供科学依据.

枯草芽孢杆菌分泌表达极耐热木聚糖酶及其酶学性质

为将海栖热袍菌极耐热木聚糖酶基因xyn B（Gen Bank登录号AY340789）在枯草芽孢杆菌Bs916中进行异源分泌表达,并阐明工程菌分泌重组木聚糖酶的酶学性质。克隆极耐热木聚糖酶基因xynB,将其与罗克霉素启动子融合,构建融合质粒载体pXYNB2,将其转化到枯草芽孢杆菌Bs916中,获得重组枯草芽孢杆菌（Bs916/p XYNB2）,并对重组芽孢杆菌分泌表达的极耐热木聚糖酶的酶学性质进行了研究。SDS-PAGE法测定重组枯草芽孢杆菌分泌的蛋白在相对分子质量43 000处有明显的蛋白表达条带。重组木聚糖酶的最适反应p H值为5.0-5.8,重组木聚糖酶的最适反应温度大于或等于100℃,重组极耐热木聚糖酶在pH值4.6-7.8比较稳定,重组木聚糖酶的温度稳定性在90℃下保温2 h后残存酶活83%。可见,生防枯草芽孢杆菌Bs916能有效分泌表达极耐热木聚糖酶,为以后构建多种纤维素和半纤维素在其中的协同表达,拓宽其碳源利用范围奠定基础。

枯草芽孢杆菌产角蛋白酶的发酵过程优化

为了实现重组角蛋白酶在基因工程菌Bacillus subtilis WB600中的高效生产,在3L发酵罐中对发酵条件和补料策略进行了优化,建立了补料分批发酵工艺.研究发现,两阶段控制pH,前6小时控制pH 7.0,后期控制pH 8.0、DO 20％,发酵过程以葡萄糖为流加碳源,7～11 h以μ为0.15 h-1指数流加、12～15 h以μ为0.1 h-1指数流加、16～27 h恒速流加葡萄糖3 g/（L·h）,在30 L发酵罐水平上,27 h酶活达到864 U/mL,生产强度为31.8 U/（mL·h）,国外报道的酶活达到2 900 mL,酶活在国内属领先水平,为重组枯草芽孢杆菌产角蛋白酶的工业化生产打下了坚实的基础.

温度两阶段控制策略发酵生产重组角质酶

为进一步提高重组Bacillus subtilis WSHB06-07发酵生产角质酶的产量和生产强度,在pH两阶段控制策略的基础上,考察了温度(27～40℃)对菌体生长和产酶的影响.研究发现,37℃适于菌体生长而30℃适于菌体产酶.通过分析发酵过程中菌体比生长速率及产物比合成速率的变化,确定了温度两阶段控制策略,即0～4h时控制温度37℃,4h后将温度调至30℃.通过采用这一优化策略,角质酶酶活和生产强度分别可达312.5U/mL和13.02kUL-1h-1,相比恒定温度37℃控制模式下分别提高了83.4%和10.9%.

冷培养对金属化合物枯草杆菌致变试验结果的影响

[目的 ]研究枯草杆菌芽孢重组修复试验中增加冷培养对金属化合物和间接致变物DNA损伤试验的影响。[方法 ]比较直接培养法与增加 4℃ 2 4h冷培养对测试结果的作用。观察指标 :最小抑菌浓度 (MIC)和敏感性。 [结果 ]增加冷培养对大多数金属化合物测试结果无影响 ,而对K2 Cr2 O4、CoCl2 、CoSO4及 2种间接致突变物 2 AF、AFB反而提高了MIC ,降低了敏感性。此结果与Kada的报道不尽一致 ,对其原因加以探讨。 [结论 ]枯草杆菌芽孢重组修复试验增加冷培养 。

过量无机盐及谷氨酸抑制重组菌核黄素发酵

在重组枯草芽孢杆菌24/pMX45核黄素发酵中,酵母粉促进核黄素合成,酵母抽提物抑制核黄素合成。分析显示,酵母抽提物的无机离子和游离氨基酸含量均高于酵母粉。在酵母粉基础发酵培养基中,添加各种无机离子和游离氨基酸,使其含量与酵母抽提物相同。摇瓶发酵结果表明:过量的无机离子和谷氨酸对核黄素合成有显著的抑制作用。酵母抽提物含有较高浓度的谷氨酸,是其抑制核黄素合成的主要原因。

高产表面活性素的重组枯草芽孢杆菌构建及培养优化

表面活性素是一种新型生物表面活性剂,因其具有良好的表面活性、可生物降解及抗菌活性,在石油开采、医药、农业和食品化妆品等领域具有广阔的应用前景。高产表面活性素菌株的获得和发酵过程优化是其商业化生产的关键。文中考察了脂肪酸合成途径对表面活性素合成的影响,强化脂肪酸生物合成关键基因以及该途径全部基因分别构建了高产表面活性素枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THBS-2和THBS-8,并对发酵过程中氨基酸种类及添加量、诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)添加时间和添加量等条件对产物合成的影响进行考察,获得优化的两阶段前体添加方案:发酵3 h,加入IPTG和L-亮氨酸,使其终浓度分别为1.25 mmol/L、5 g/L;发酵24 h,添加L-亮氨酸(终浓度5 g/L)和浓缩培养基5 mL。优化条件下,枯草芽孢杆菌THBS-2摇瓶发酵48 h,表面活性素产量高达24 g/L;30 L发酵罐中发酵68 h,产物产量最高达到34 g/L。研究结果为表面活性素的工业化生产及应用奠定基础。

重组Bacillus subitilis(pMA5/lapgad)的构建及其在γ-氨基丁酸合成中的应用

从实验室保存的Lactobacillus plantarum ZJ3443中克隆得到GAD基因,并对其进行了生物信息学分析。利用得到的GAD基因构建质粒pMA5/lapgad,在Bacillus subtilis WB600系统中实现了GAD基因的异源重组表达,其胞内酶活达到0.35 U/mg。在此基础上对摇瓶下利用重组菌全细胞转化谷氨酸合成γ-氨基丁酸的条件进行了优化,其最佳条件为:转化温度37℃,转化pH为4.5,添加1 mmol/L Ca2+作为激活剂。这是国内首次报道GAD在枯草芽孢杆菌中的活性表达,为利用基因工程技术实现全细胞合成γ-氨基丁酸打下了基础,为生产实践提供了一定的指导意义。