重组蛋氨酸酶在猕猴体内的药动学、免疫原性及系统毒性

目的重组蛋氨酸酶(rMETase)对于人系外源性蛋白酶,该酶在人肿瘤裸鼠模型中表现出广泛的抑瘤作用。本实验以灵长类动物猕猴为研究对象,测定了rMETase的药动学、免疫原性及系统毒性。方法与结果rMETase单次静脉注射1000u/kg、2000u/kg和4000u/kg时,猕猴血浆蛋氨酸水平在30min内可降低至无法检测的水平(小于0.5μmol/L),且持续4h;给药剂量4000u/kg时,血浆蛋氨酸低于1μmol/L的水平,可维持8h。rMETase在猕猴体内的t1/2为2.49h,给药2000u/kg和4000u/kg时的CL分别为11.28ml/h和30.77ml/h;rMETase以4000u/(kg.8h)重复给药2周时,可使血浆蛋氨酸水平在给药期间维持在2μmol/L以下;重复大剂量给药的主要系统毒性表现为食量减少、体重轻微下降,血浆白蛋白和红细胞水平呈可逆性降低。当rMETase重复给药2周后的28d再次给药时,出现过敏性休克,其中有1只动物死亡;及时给予激素抢救可避免死亡,或给药前给予氢化可的松可预防过敏性休克发生。在实验后的66、86和116d时再次给药,首次给药后抗rMETase抗体水平为10-3,第4次给药后增加到10-6;在以后的2个月内抗体水平降低至10-2。抗rMETase抗体类型主要是IgG,体外检测系中和性抗体;但在体内对rMETase降低血浆蛋氨酸作用的影响较小。结论系统研究表明,rMETase在猕猴模型中能有效地降低血浆中蛋氨酸水平,出现的系统毒性反应很小;rMETase是一具良好前景的广谱抗肿瘤新药,但应重视其免疫原性,如能进行化学修饰或其它处理则可增加药物的作用时间并降低其免疫原性,增加用药安全性。

两种重组蛋氨酸酶表达条件优化及其对人肺腺癌细胞GLC的抑制作用研究

目的:优化两种重组蛋氨酸酶表达的诱导条件,并探讨其对宣威人肺腺癌细胞GLC的抑制作用。方法:将重组蛋氨酸酶表达质粒PGEX-4T1-4A1-MGL和PGEX-4T1-3B8-MGL转染至感受态大肠杆菌DH5α中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。以目标蛋白表达量为指标,采用单因素试验对诱导前菌液起始光密度(OD600 nm)值、培养温度、诱导时间等诱导条件进行优化。采用亲和层析法对所得重组蛋氨酸酶4A1-MGL、3B8-MGL进行纯化;采用考马斯蓝法检测其质量浓度,十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测其纯度,分光光度法检测其活性。采用MTT法检测经低、中、高剂量重组蛋氨酸酶(4A1-MGL和3B8-MGL分别均为0.1、0.2、0.4 U/mL)作用24、48、72 h后的细胞增殖情况,并计算细胞抑制率。结果:两种重组蛋氨酸酶表达的最优诱导条件为菌液起始OD600 nm值0.9、培养温度37℃、诱导时间5 h。验证试验结果显示,4A1-MGL、3B8-MGL的蛋白表达量分别为1.52±0.04、1.28±0.03(RSD<3%,n=3)。经纯化后,4A1-MGL的质量浓度为(0.70±0.02)mg/mL,纯度为(96.42±3.15)%,活性为(0.45±0.02)U/mg;3B8-MGL的质量浓度为(0.56±0.02)mg/mL,纯度为(97.43±2.96)%,活性为(0.91±0.03)U/mg。经低、中剂量4A1-MGL和3B8-MGL作用48、72 h,高剂量4A1-MGL和3B8-MGL作用24、48、72 h后,GLC细胞的抑制率均显著升高,且高剂量组作用72 h时显著高于同时间点低、中剂量组(P<0.05)。结论:本研究成功优化了重组蛋氨酸酶表达的诱导条件,所得4A1-MGL和3B8-MGL可剂量依赖性地抑制GLC细胞增殖。