重组融合蛋白GX1-rmhTNFα的克隆、表达及鉴定

目的构建胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子(GX1-rmhTNF)基因的原核表达载体,表达GX1-rmhTNF蛋白。方法利用基因工程方法将胃癌血管特异性结合肽融合在新型人肿瘤坏死因子α的氨基末端,构建GX1-rmhTNF原核表达载体,在大肠杆菌进行表达。对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Westernblot检测分析。结果成功构建了GX1-rmhTNF重组融合表达质粒,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在相对分子质量(Mr)约18000处出现了1条新生的蛋白条带,该表达蛋白具有与TNFα单克隆抗体特异性的结合能力。结论成功构建了GX1-rmhT-NF基因的原核表达载体并在原核细胞中表达了该产物,为下一步GX1-rmhTNF的纯化奠定了基础。

葡萄球菌肠毒素B基因原核表达系统的构建及其表达产物促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的研究

构建葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxins B，SEB）基因原核表达系统，了解重组表达产物rSEB促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用．采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株DNA中扩增全长SEB基因片段，T—A克隆后测序，构建SEB基因原核表达系统pET32α-SEB—E．coliBL2IDE3．采用SDS-PAGE检测rSEB表达产量，Ni—NTA亲和层析法提纯rSEB．采用TCID50法测定rSEB对Vero细胞的细胞毒性作用并计算TCID50值．采用MTT比色法分别检测不同浓度rSEB体外对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞（PBMC）的促增殖作用以及对HepG2细胞（人肝腺癌细胞）、HeLa细胞（人宫颈癌上皮细胞）的生长抑制作用．与公布的相关序列比较，所克隆的SEB基因核苷酸序列相似性为100％．rSEB表达量约为细菌总蛋白的40％．rSEB对Vero细胞的TCIC50为3．02μg．5．0～20．0μg／ml的rSEB对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用（P〈0．05）．5．0～20．0μg／ml rSEB作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长（P〈0．05）．本研究成功地构建了rSEB高效原核表达系统．rSEB仍然具有生物学活性．所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法，为以后减毒rSEB突变体的筛选奠定了基础．

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因改建及其表达产物粘膜免疫佐剂活性的研究(英文)

目的改建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因序列以提高重组LTB(rLTB)原核表达量,确定重组改建LTB(rrLTB)粘膜免疫佐剂活性。方法按大肠杆菌偏爱密码子合成全长LTB基因的核苷酸序列。构建pET32a-rLTB原核重组表达质粒及pET32a-rLTB-E.coliBL21DE3表达系统,提取重组质粒并测定其插入的rLTB基因序列。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶成像分析系统鉴定rrLTB表达产量,并与未改建的重组LTB(roLTB)比较。采用GM1-ELISA确定rrLTB和roLTB结合牛GM1的能力。分别以幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位(rUreB),检测rrLTB和roLTB对rUreB对幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠保护作用及产生特异性S-IgA的增强效应。结果pET32a-rLTB-E.coliBL21DE3经1 mmol/LIPTG诱导后,rrLTB表达量约占细菌总蛋白的35.4%,为roLTB(2.8%)的12.6倍。GM1-ELISA结果证实rrLTB和roLTB均能与牛GM1结合。单一rUreB对感染小鼠的免疫保护率为66.7%,但与rrLTB或roLTB合用时,保护率可至91.6%,并可提高感染小鼠特异性S-IgA产生量(P<0.01)。结论改建的LTB基因能明显提高表达量,所表达的rrLTB仍保持较强的粘膜免疫佐剂活性。

大肠杆菌LTKA63突变体的构建及重组LTKA63免疫佐剂活性机理的研究

目的 构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位（heat-labile enterotoxin subunitA，LTA）基因减毒突变体LTKA63及其原核表达系统，探讨重组LTKA63（rLTKA63）粘膜免疫佐剂活性的机制。方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA基因，利用定位突变技术构建LTKA63突变体，T-A克隆后测序。采用无His-tag的原核表达载体pET-15b。构建LTKA63原核表达系统，通过SDS-PAGE鉴定表达产物。采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径。结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA基因条带。与报道的LTA序列比较，所克隆的LTA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．03％～99．61％和98．33％～99．22％。LTA基因定位突变后获得序列正确的LT-KA63突变体。rLTKA63表达量占细菌总蛋白的15％左右。rLTKA63作用后Th1和Th2细胞较阴性对照组分别增加21．9％和36．2％。结论本文成功地构建了LTKA63原核表达系统，所表达的rLTKA能同时激活Th1和Th2细胞。

小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2的原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠睾丸特异表达基因Biot2的原核表达载体,表达pQE30-Biot2融合蛋白。方法提取小鼠睾丸组织总RNA,经RT-PCR扩增Biot2基因片段,并将其克隆入原核表达载体pQE30中,构建重组质粒pQE30-Biot2。经限制性内切酶BamHI、HindIII双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliXL-Blue,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测。结果构建pQE30-Biot2重组原核表达质粒,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量(Mr)约17700处出现了1条蛋白条带,该表达蛋白具有与His-tag单克隆抗体(mAb)特异性的结合能力。结论成功地构建了Biot2基因的原核表达载体,并表达出pQE30-Biot2重组蛋白,为下一步制备多克隆抗体和蛋白功能的深入研究奠定了实验基础。

大肠杆菌重组LTKA63突变体和LTB黏膜免疫佐剂活性的研究

目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位(heat-labile enterotoxin subunit A,LTA)突变体 LTKA63及B亚单位(heat-labile entemtoxin subunit B,LTB)基因原核表达系统,确定rLTKA63和rLTB黏膜免疫佐剂活性。方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA和LTB基因,采用定位突变技术构建LTKA63突变体,T-A克隆后测序。构建LTKA63和LTB原核表达载体,采用SDS-PAGE鉴定表达产物。采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径,以GM1-ELISA检测rLTB结合牛GM1的能力。建立幽门螺杆菌SS1株小鼠感染模型,分别以幽门螺杆菌(Hp)重组尿素酶B亚单位(rUreB)和黏附素(rHpaA)为抗原,分别检测rLTKA63和rLTB对rUreB和rHpaA的免疫保护增强作用。结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA和LTB基因条带。LTA基因定位突变后获得序列正确的LTKA63突变体。rLTKA63和rLTB表达量分别占细菌总蛋白的30％和20％左右。LTKA63作用后T_H1 和T_H2细胞较阴性对照组分别增加19．9％和42．3％,GM1-ELISA结果证实rLTB能与牛GM1结合。 33．3％(4／12)rUreB和41．7％(5／12)rHpaA免疫小鼠胃黏膜标本中分离出幽门螺杆菌,且rUreB和rHpaA特异性S-IgA检测结果均为阴性。rUreB或rHpaA加用rLTKA63或rLTB免疫后,小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌分离阳性率下降为16．7％～25．0％(P>0．05),rUreB和rHpaA特异性S-Iga阳性率可达41．6％- 58．3％(P<0．01)。结论成功地构建了LTKA63和LTB原核表达系统,所表达的rLTKA63和rLTB均具有较强的黏膜免疫佐剂活性。