立氏立克次体蛋白抗原基因的表达和重组蛋白抗原的免疫印迹分析

目的表达立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)主要抗原基因,免疫印迹初步分析重组蛋白抗原的抗原性。方法根据立氏立克次体全基因组序列选出主要抗原相关基因,采用PCR从全基因组中扩增抗原相关基因,将扩得的基因片段插入原核表达质粒构建抗原基因重组表达质粒,将重组质粒转化大肠杆菌并诱导转化菌表达重组蛋白抗原。采用立氏立克次体感染的豚鼠血清和斑点热患者血清分别与纯化的重组蛋白抗原做免疫印迹分析。结果经PCR扩增后获得43个目的基因片段,其中36个基因片段在大肠杆菌中高效表达重组蛋白抗原,其中5个蛋白抗原在免疫印迹中与感染豚鼠血清和斑点热患者血清反应均为阳性。结论免疫印迹筛选出5种立氏立克次体重组蛋白抗原,结果提示它们是能够诱导机体产生特异性免疫应答的主要抗原,可作研制斑点热诊断试剂或亚单位疫苗的新候选蛋白抗原。

普氏立克次体重组表面蛋白制备和免疫印迹抗原特异性分析

目的克隆与表达普氏立克次体(Rickettesia prowazekii)主要蛋白抗原基因,分析所表达重组蛋白的抗原特异性。方法采用PCR法从普氏立克次体全基因组中扩增其主要抗原基因,将扩得的基因片段插入原核表达质粒;将基因重组表达质粒转化大肠杆菌,用IPTG诱导转化菌表达重组蛋白。将普氏立克次体、莫氏立克次体、立氏立克次体、恙虫病东方体、黑龙江立克次体、贝氏柯克斯体等实验感染小鼠血清与重组蛋白做免疫印迹。结果经过PCR扩增后获得9个目的基因片段,用其构建出9个原核表达质粒;9个原核表达质粒转化菌均高效表达出相应的重组蛋白;结果显示FtsZ、GroEL、Rp828、EF-Ts等4个蛋白特异性最好,仅与普氏立克次体感染小鼠血清反应;其次是Omp,它除与普氏立克次体感染小鼠血清反应外,仅与莫氏立克次体感染血清反应。结论 FtsZ等4个重组蛋白为普氏立克次体的特异性抗原,可以作为研制流行性斑疹伤寒血清学诊断试剂的候选抗原。

猪肺炎支原体膜蛋白的电泳分析及免疫印迹检测

以猪肺炎支原体Z株为试验材料,采用SDS-PAGE和Western印迹对该菌膜蛋白进行了分析.研究表明:猪肺炎支原体经A26液体培养基培养,15 000r/min离心收集菌体细胞,低渗超声法破膜获得膜制剂后,应用12.5％的凝胶对膜蛋白进行SDS-PAGE分离,在电泳图谱上呈现出36条蛋白带,相对分子质量范围为1.18×104～9.12×104.同时以膜制剂作为抗原,分4次免疫试验兔,心脏采血,提取抗血清,并分离纯化得到IgG,然后进行Western印迹法检测.其结果发现在SDS-PAGE分离得到的36种膜蛋白(或多肽)中,有6种蛋白具有免疫原性.

人血浆因子V蛋白免疫印迹分析及其临床应用

目的 建立人血浆因子Ｖ（ＦＶ）蛋白免疫印迹分析，对遗传性ＦＶ缺乏症家系成员血浆ＦＶ含量进行分析。方法 以３３％饱和硫酸铰从多克隆兔抗人ＦＶ抗血清中纯化ＩｇＧ，待测血浆行４％～１２％梯度的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，继之电转印至硝酸纤维膜上。结果 在３３０ ｋＤ附近，正常人混合血浆呈现一明显的条带，患者母亲对应条带的显色强度明显弱于正常对照，而患者则完全缺如，且未能检出其他较小的ＦＶ片段产物。结论 我们建立的人血浆ＦＶ蛋白免疫印迹分析法对于遗传性ＦＶ缺乏症的辅助诊断及分型具有重要作用。该家系属于Ｉ型遗传性ＦＶ缺乏。

犬链球菌重组M蛋白的免疫学分析

为了研究犬链球菌感染的免疫保护机制,试验通过筛选犬链球菌3～8 kb随机基因组文库,获得阳性克隆,测序拯救质粒得到序列,通过Blast分析确定此片段为犬链球菌M蛋白基因,并根据序列设计特异性引物PCR扩增并克隆和表达M蛋白基因。结果表明:M蛋白与兽疫链球菌和产脓链球菌的保护性抗原及马链球菌M蛋白基因同源率高,用纯化M融合蛋白免疫兔制备的血清对小鼠具有保护性作用。

老年期痴呆患者血清Tau蛋白免疫印迹分析

目的 探讨血清Tau蛋白水平对老年期痴呆患者临床诊断的意义.方法 应用单克隆抗Tau蛋白抗体(Anti-Tau l)和免疫狭缝印迹(ISB)技术对112例老年期痴呆患者[Alzheimer病(AD)75例、多发性梗塞性痴呆(MID)37例]和24名年龄配对的老年健康人的血清测定Tau蛋白水平,用分子分析仪并联计算机(IBM)扫描进行分析,血清Tau蛋白的相对浓度以校准强度(CI)表示.结果 本研究显示老年期痴呆患者组的血清Tau蛋白含量(CI值:总计=0.114±0.03,AD=0.110 ±0.03,MID=0.123 ±0.04)与对照组(CI值为0.116±0.04)的差异无显著性(P值均>0.05),也不受有或无apo E_4等位基因(∈_4)的影响.结论 在临床上诊断老年期痴呆时,有必要采用相同技术对脑脊液(CSF)中的和血清中的Tau蛋白进行同步分析比较.

副溶血性弧菌外膜蛋白BamA重组表达及其免疫原性分析

副溶血性弧菌外膜蛋白BamA是β-桶组装BAM复合物的核心成分,参与细胞外膜蛋白运送和安装过程,是潜在的新型靶标抗原,目前其在免疫检测抗原和疫苗中的潜在价值尚未有研究报道。本研究通过生物信息学软件SnapGene和Protean分析BamA的序列并筛选出多肽,采用PCR扩增出外膜蛋白BamA的基因片段,构建重组质粒pET-28a(+)-BamA;经大肠杆菌BL21诱导表达BamA重组蛋白(90ku);多肽与BSA偶联,制备的抗原免疫BALB/c小鼠制备了血清。采用酶联免疫分析(ELISA)和蛋白质印迹法(Westernblot)测定BamA蛋白及多肽免疫血清对24株弧菌的交叉反应。ELISA测定结果表明,免疫血清对BamA蛋白的效价在121K以上,对副溶血性弧菌等弧菌的效价较弱(0.5K);免疫印迹结果显示,BamA蛋白血清与副溶血性弧菌CICC21617、CICC21618、杀岩龙虾弧菌和非O1型霍乱弧菌等弧菌属细胞裂解物中90ku左右的蛋白可发生特异性反应,而对费氏另类弧菌、嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌等非弧菌属无交叉反应。弧菌外膜蛋白BamA具有弧菌属保守性并可以诱导产生弧菌特异性抗体,多肽在菌体表面的暴露性可能受到其他抗原的影响,这给后续弧菌诊断抗原和疫苗抗原研究提供了依据。

芜湖地区无偿献血者HIV感染状况及蛋白质免疫印迹分析

目的了解本地区无偿献血者HIV-1抗体检测及蛋白印迹试验的确证情况,探讨进一步控制血液质量安全的策略及方法。方法无偿献血者献血后使用酶联免疫和病毒核酸检测方法进行初步筛查,对筛查阳性标本送市疾控进一步做抗-HIV蛋白质免疫印迹(WB)试验。回溯性调查近10年本地区无偿献血者HIV抗体确证结果,分析阳性标本的WB条带特点,并分析无偿献血者中HIV感染者的人口学特征。结果 2011年1月~2021年5月,本次调查无偿献血者血液标本共354 864份,其中HIV确证阳性42份(含41份抗-HIV-1确证阳性,1份单HIV RNA反应性),HIV总感染率为11.8/10万(42/354 864)。不同性别、婚姻状态和职业差异均有统计学意义。男性占97.6%(41/42),女性占2.4%(1/42)。未婚献血者感染率(17.3/10万)显著多于已婚(8.0/10万),职员/职工组的感染率(37.5/10万)显著高于学生组(11.4/10万)和其他组(7.7/10万)。阳性者的WB条带中,gp160检出率为100%(41/41),gp41和p24条带的检出率均为97.6%(40/41),p55检出率最低,为46.3%(19/41),p51、p66的检出一致性最高(kappa=1.000,P<0.05)。筛查出有4例单HIV RNA反应性献血者,经病毒载量(VL)检测有1例>5 000 cps/mL,为HIV窗口期感染。结论芜湖地区无偿献血人群的HIV感染者中男性显著多于女性,通过WB条带分析发现感染者大多处于早期感染阶段,核酸检测对HIV窗口期感染者的检出和确证有重要作用,是血液安全的有力保障。

蛋白免疫印迹和全自动蛋白质定量分析的比较研究

目的:比较传统的蛋白免疫印迹和全自动蛋白质定量分析检测特异性蛋白质相对含量的差异,并进行方法学优化,为蛋白质定量分析提供技术参考。方法:分别使用两种系统对不同分子量的目标蛋白进行检测,比较两种系统的灵敏度、重复性和适用范围。结果:相比传统WB系统,全自动系统灵敏性、重复性和稳定性更高,并且可进行多分子同时检测,尤其在检测微量蛋白、分子量较大或较小的蛋白以及高通量方面具有优势。结论:全自动蛋白检测是一种灵敏、高效的检测特异性蛋白丰度变化的系统,值得在科研和医学检验中推广。

重组抗原免疫印迹法排查化学发光免疫分析法检测梅毒螺旋体抗体假阳性的价值

目的分析重组抗原免疫印迹法(RAWB)排查化学发光免疫分析法(CLIA)检测梅毒螺旋体抗体假阳性的价值。方法收集2019年1月至2020年8月于医院采用CLIA得到的梅毒螺旋体抗体阳性的血清样本66份,涉及64例患者,按照年龄分为21~50岁34例(第1组),51~70岁13例(第2组),71~89岁17例(第3组),出现二期梅毒临床症状的患者15例(在第1组内),样本17份(有2例为治疗前后双份血清),对样本行RAWB和免疫印迹法(WB)检测,以WB检测结果为金标准,分析CLIA检测结果,比较CLIA、RAWB、WB检测结果及不同年龄组患者的RAWB与CLIA检测结果。结果CLIA与RAWB的检测结果比较,差异有统计学意义(P<0.05);CLIA与WB的检测结果比较,差异有统计学意义(P<0.05);RAWB与WB的检测结果比较,差异无统计学意义(P>0.05);CLIA与RAWB检测第1组的结果比较,差异无统计学意义(P>0.05);CLIA与RAWB检测第2、3组的结果比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论CLIA检测梅毒螺旋体抗体存在一定的假阳性情况,RAWB可帮助临床排查假阳性结果,当患者CLIA检测结果为弱阳性时,则需根据其个体特征综合分析,必要时可通过RAWB排查。

肝片吸虫18.6kD蛋白抗原双向电泳及免疫印迹分析

从分子水平上研究了肝片吸虫的抗原组分 ,用制备性 SDS- PAGE纯化 ES18.6 k D蛋白抗原 ,并用它成功制备了单因子兔抗血清 ,用这种抗血清来分析肝片吸虫各部分抗原 ,证实各部分抗原的 18.6 k D多肽具有相同的抗原决定簇 ,而且这种抗原决定簇不存在于其它分子量的多肽中。体抗原 (BA)和分泌排泄抗原 (ES)的双向电泳(Two- dimention Electrophoresis,2 - D)分析研究表明 ,肝片吸虫同一种分子量的蛋白质大多由多种等电点不同的多肽组成 ;同时也显示了体抗原和分泌 -排泄抗原分子量相同的蛋白质所包含的多肽数量和性质是有差异的。

重组表达的着丝粒蛋白-B N-端抗原在抗着丝粒自身免疫病血清检测中的应用

目的 分析重组表达的CENP B抗原对抗着丝粒自身免疫病血清的鉴定结果 ,探讨其作为临床诊断指标的可行性。 方法 通过构建原核表达载体 ,在大肠杆菌中高效表达CENP BN端 30 0个氨基酸的 1段多肽 ;纯化包涵体 ,制备重组表达的CENP B抗原 ,并利用ELISA、Westernblot的方法对临床诊断为阳性的ACA血清进行鉴定。 结果 重组表达的CENP BN 端抗原对ACA血清的ELISA阳性检出率为 99% ,Westernblot阳性检出准确率为 97%。 结论 重组表达的CENP B抗原可以作为抗着丝粒自身免疫病血清临床诊断的 1个指标。

我国HIV-1 B'/C重组流行株Tat蛋白的表达、纯化及功能分析

根据全国HIV分子流行病学研究发现,B'和C亚型HIV-1在我国发生了重组,并以优势株形式在我国广泛流行。为了探讨这种HIV-1B'/C重组毒株tat基因的变异与其表型之间的关系,利用pET表达系统在大肠杆菌中高效表达了三种不同基因变异类型的Tat蛋白,重组蛋白占菌体总蛋白的26%,Westernblot显示较好的反应原性,并通过金属鏊合层析纯化了目的蛋白。荧光素酶活性检测表明:体外表达的Tat蛋白具有明显的生物学活性,可以反式激活HIVLTR引导的报告基因的表达;三种Tat蛋白在激活活性上的差异与流行现场检测的病毒载量的高低存在明显的对应关系,说明tat基因的变异可以引起病毒生物学特性的改变,进而影响病毒的流行特征。此结果为进一步研究我国HIV重组毒株的基因变异特征及变异规律奠定了基础。

鹅细小病毒主要免疫原性蛋白基因的克隆与序列分析

利用PCR技术 ,从纯化鹅细小病毒SYG99-5毒株鹅胚尿囊液中扩增出病毒主要免疫原性蛋白基因。将该PCR扩增片段克隆入 pGEMR-T质粒载体的HincⅡ和SacⅠ位点之间 ,酶切分析筛选并进一步通过Southern杂交验证后 ,获得含 1 6kb基因片段的重组质粒GpG3 。序列测定结果表明 ,该片段与国外已报道的GPVB株苷酸序列有 96 %的同源性 ,氨基酸序列有

不同临床分期HIV-1感染者/AIDS患者血样的蛋白印迹试验带型分析

目的分析各临床分期的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者/获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者血清中病毒蛋白抗体的变化,探讨不同临床分期的HIV-1感染者/AIDS患者蛋白印迹试验(WB)的带型特点。方法对汕头市2009至2012年确证的部分HIV-1抗体阳性病例进行CD4+T细胞计数,根据计数结果对病例进行分组:原发感染期组(CD4+≥500/mm3);感染中期组(CD4+≥200/mm3且<500/mm3);AIDS期组(CD4+<200/mm3);对各组的WB结果进行病毒蛋白(p17、p24、p31、p39、gp41、p51、p55、p66、gp120、gp160)抗体的阳性率统计以及带型分析。结果病毒蛋白p24、p31、gp41、p51、p66、gp120和gp160的抗体阳性率较高(总阳性率分别为98.2%、92.0%、90.8%、89.5%、93.3%、98.7%和97.5%),且在3个分期组间未见明显变化(P>0.05);病毒蛋白p17、p39和p55呈现较低的抗体阳性率(总阳性率分别为68.9%、49.1%和42.5%);蛋白p17的阳性率从原发感染期的91.5%降为感染中期的62.8%(P<0.01)及AIDS期59.3%(P<0.01);WB结果中的全带型、缺失p39+p55和缺失p17+p39+p55的带型是3个疾病分期组患者的常见带型;在3个分期组中,原发感染期中全带型出现率最高(60.8%),而缺失p17+p39+p55的出现率最低(6.5%)。结论病毒蛋白p17抗体的阴转可以作为疾病从原发感染期进入感染中期/AIDS期的一个潜在判别指标。

红藻氨酸诱导大鼠癫痫发作脑组织HSP70表达的免疫组化及免疫印迹分析

目的探讨热休克蛋白（ＨＳＰ）７０在癫痫发作后的表达及作用。方法用免疫组化及免疫印迹分析法观察红藻氨酸诱导大鼠癫痫发作后ＨＳＰ７０的表达及其动态演变过程。结果正常海马结构含有一定量的组成性ＨＳＰ７０（ＨＳＣ７０），发作后３ｈ即有ＨＳＰ７０表达，２４ｈ达高峰（Ｐ＜０．０１），４８ｈ开始下降，持续至少７ｄ。在２４ｈ，ＨＳＰ７０免疫反应（ＨＳＰ７０－ＩＲ）阳性细胞主要分布在边缘结构。结论ＨＳＰ７０表达是癫痫发作所致细胞损伤的标志，并可能预示细胞死亡或存活。

免疫印迹法测定Tp47蛋白与梅毒患者血清的免疫反应性

目的克隆Tp47基因、构建原核表达载体、表达并纯化Tp47蛋白,通过免疫印迹法(Western-Blot)检测其免疫反应活性。方法聚合酶链反应扩增Tp47基因,将Tp47克隆至pGEX-6P-1载体,构建重组表达质粒pGEX-6P1-Tp47,经测序鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经诱导表达后,用亲和层析方法纯化重组蛋白,鉴定正确后采用Western-Blot检测重组蛋白与梅毒阴性、阳性血清的免疫反应性。结果成功构建pGEX-6P1-Tp47原核表达质粒,表达、纯化后获得了相对分子质量约为71×103的重组蛋白;Western-Blot检测显示其能与梅毒阳性患者血清发生特异性反应,而与梅毒阴性患者血清无交叉反应性。结论成功克隆、表达、纯化Tp47重组蛋白,其与临床各期梅毒患者血清具有较好的免疫反应性,为Tp47重组蛋白用于梅毒早期诊断提供了理论依据。

查菲埃立克体P28蛋白抗原免疫印迹调查犬单核细胞埃立克体病

目的 以查菲埃立克体P2 8蛋白抗原免疫印迹法对犬单核细胞埃立克体病作流行病学调查 ,为该病的防治提供依据。方法 收集广东犬埃立克体病发生地的犬血清 ,用基因工程制备的查菲埃立克体P2 8融合蛋白抗原与犬血清作免疫印迹 ,检测犬血清中的抗P2 8抗体。结果 2 12份犬血清行免疫印迹 ,89份 (42 % )阳性 ;这些阳性反应的血清绝大部分来自广州市和深圳市的野外工作犬 ,而南海市观赏犬的血清均为阴性。广西省南宁市的野外工作犬的 36份标本仅 3份为弱阳性。高水平的P2 8抗体出现在 4～ 10月 ,与当地蜱的活动期平行。结论 犬单核细胞埃立克体病在我国为局部流行 。

贝氏柯克斯体感染小鼠血清与其毒力相关蛋白的免疫印迹反应

目的筛选与贝氏柯克斯体感染血清反应的贝氏柯克斯体毒力相关蛋白。方法以贝氏柯克斯体标准株九里株为模板,采用PCR扩增包括IV型分泌系统、分泌性蛋白和膜蛋白在内的毒力及毒力相关的基因,将扩得目的基因片段与原核表达质粒pET32a重组,将重组质粒转化大肠杆菌,用贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清与转化大肠杆菌作免疫印迹。结果设计173对引物共扩增出170个目的基因,经PCR及酶切鉴定,有155个基因与pET32a质粒重组成功,SDS-PAGE电泳分析发现,共有104个转化菌表达目的蛋白,在104个重组蛋白中,筛选到32个与贝氏柯克斯体感染小鼠血清反应的重组蛋白。结论这些与贝氏柯克斯体感染血清反应的毒力相关蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。

日本血吸虫腺苷酸激酶基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价

目的 将亚克隆入 pET3 2a( +)质粒的日本血吸虫腺苷酸激酶 (adenylatekinase ,AK )基因进行表达及蛋白纯化 ,并对表达产物的免疫反应性进行评价。 方法 将重组表达质粒 pET3 2a( +) AK转入宿主菌大肠埃希菌BL2 1,异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达后超声裂菌 ,离心 ,取上清进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE) ;将SDS PAGE后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜上 ,分别用 6 组氨酸 ( 6 His)抗体、日本血吸虫尾蚴感染6wk的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清为一抗进行蛋白质印迹试验 (Westernblotting) ;用金属Ni螯合物亲和层析树脂 (Ni NTA)层析柱纯化目标蛋白 ;以纯化后的融合蛋白为包被抗原 ,酶联免疫吸附测定 (ELISA)检测正常兔血清和血吸虫感染兔血清。 结果 重组菌用IPTG诱导表达后进行SDS PAGE ,于相对分子质量 (Mr) 40 0 0 0处见一特异表达带 ,与预期表达的融合蛋白大小相符 ;Western印迹分析显示该重组的融合蛋白带有预期的 6 His基团 ,且能与尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清发生特异性反应 ;ELISA结果显示纯化的重组AK蛋白可以特异识别血吸虫感染兔血清。 结论 AK基因在工程菌中以可溶性融合蛋白的形式得到表达 。