ERF类转录因子OPBP1基因重组质粒的构建及蛋白质表达

探讨了OPBP1基因的蛋白质表达方法 .利用DNA重组技术 ,将pGEM -OPBP1和pET - 32a分别进行SalⅠ和NotⅠ双酶切 ,连接 ,获得了重组质粒pET -OPBP1质粒 .IPTG诱导其蛋白质表达 .

提高基因工程中重组蛋白质表达效率及可溶性产物的一种新方法

目的:建立一种使基因工程中重组蛋白质高效表达并提高可溶性比率的新方法。方法:2002-09/2005-03在新乡医学院分子生物研究室用不含葡萄糖的M9ZB培养基分别培养转化过的含Tac启动子或T7启动子的工程菌,采用终浓度为0.02mmol/L的IPTG及5mmol/L的乳糖进行诱导。采用SDS-PAGE及岛津薄层扫描分析仪进行表达效率检测、蛋白可溶性的扫描分析。结果:用常规方法(1mmol/LIPTG,LB培养基)诱导,重组基因的表达效率不高,表达量占菌体总蛋白25%,且可溶性产物比例较低,占表达蛋白的20%,采用0.02mmol/L的IPTG及5mmol/L乳糖诱导后重组蛋白表达效率占菌体总蛋白的65%,可溶性产物比例亦大幅升高占表达蛋白90%～93%,此方法没有选择性,对T7启动子表达系统和Tac启动子表达系统均有效。结论:采用0.02mmol/L的IPTG及5mmol/L乳糖诱导后,不仅使含Tac启动子或T7启动子的表达系统中重组蛋白表达增加而且产物可溶性升高。

HSP-沙眼衣原体MOMP T细胞表位基因的重组、原核表达和蛋白质纯化

目的:构建热休克蛋白65(HSP65)与沙眼衣原体(C．trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(MOMP) T细胞表位(简称ctml)融合蛋白(简称H-ctml)的原核表达载体,并将其表达及纯化。方法:用PCR技术获得HSP65基因和ctml基因,并分别将其克隆入pMD18-T载体,采用酶切与连接的方法从pMD18-T载体上获得HSP65基因片段,并将其克隆入pET28a表达质粒,再用相同的方法将ctml基因连接于HSP65基因片段的下游,从而完成H-ctml的基因重组。用IPTG诱导转化H—ctml表达载体的大肠杆菌,以镍金属螯合亲和层析法纯化融合蛋白质。结果:构建了HSP65与ctml的表达载体pET28a-H—ctml,DNA序列测定结果表明构建正确。以镍金属螯合亲和层析获得纯度为98％的融合蛋白质。结论:用分子克隆技术正确构建HSP65与 Ct MOMP T细胞表位融合蛋白的表达载体,并成功表达与纯化出具有生物活性的融合蛋白。

生物样品中蛋白质和肽类药物测定方法的研究进展

随着生物技术的发展和基因工程技术的应用，越来越多的蛋白质和肽类药物被开发并应用于临床，如重组干扰素α-2a、重组人白介素-2等。这类药物生理活性强、疗效高，日益受到人们的重视。由于蛋白质和多肽类药物与化学合成小分子药物在理化性质、药动学特点等方面存在明显的差异，体内过程的影响因素也较复杂，而对生物样品中蛋白质和肽类药物的测定则是深入探讨其药动学特点及规律的主要难点。

重组人生长激素对老年胸外伤患者蛋白质代谢及免疫功能的影响

目的:探讨重组人生长激素(rh GH)对老年胸外伤患者蛋白质代谢及免疫功能的影响。方法:98例老年胸外伤患者随机均分为观察组和对照组,对照组给予标准肠内营养治疗,观察组在对照组治疗基础上给予rh GH治疗,观察并比较2组患者治疗前后血清蛋白水平和免疫功能变化。结果:治疗前,两组患者血清白蛋白、血清前白蛋白以及血清转铁蛋白浓度比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗后观察组显著高于治疗前(P<0.01),而对照组无明显变化(P>0.05);治疗后观察组显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);治疗前,两组患者血清Ig A、Ig G、Ig M、CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗后观察组Ig A、Ig G、Ig M、CD3及CD4/CD8均显著高于治疗前,对照组仅Ig A、Ig G、Ig M显著增高,而CD3、CD4、CD4/CD8显著降低,差异均有统计学意义(P<0.01);治疗后观察组Ig A、Ig G、Ig M、CD3、CD4及CD4/CD8均显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:rh GH用于老年胸外伤治疗能促进机体蛋白质含量增加,并能够提高CD3、CD4及CD4/CD8水平,改善患者机体免疫功能。

蛋白质及多肽类药物多种剂型给药系统的研究进展

生物技术药物（biotechdrugs）是采用DNA重组技术或其他新生物技术生产的药物.生物技术药物的研究和开发,已经成为医药产业中的一个重要的领域.具有生理活性蛋白、多肽属于生物技术类药物.

5种结核分枝杆菌特异蛋白质的抗原性分析

目的评价14、16、38kD、mtb81和ESAT-6等5种结核分枝杆菌特异蛋白质的抗原性。方法利用14、16、38kD、mtb81和ESAT-6等5种重组蛋白建立ELISA方法,检测120份结核病人、30份非结核呼吸道感染病人和30份健康人血清中相应抗体。结果ELISA显示5种结核杆菌特异性蛋白质的特异性均高于95%;敏感性和准确性则不尽相同,其中38kD的检测敏感性最高,为80.8%;14、16kD、mtb81和ESAT-6的检测敏感性分别为52.5%、68.3%、35.8%和44.2%。结论5种结核杆菌特异性蛋白质均具有不同程度的抗原性。进一步提高抗原或抗体的检测灵敏度将有利于结核病的诊断。

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白治疗类风湿关节炎疗效分析

目的观察不同剂量重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR:Fc)治疗类风湿关节炎(RA)患者的疗效,了解不同剂量、不同用法之间的优劣,为临床用药提供依据。方法将60例RA患者根据治疗方案平均分为3组(低、中、高剂量组):低剂量组每次rhTNFR:Fc 25.0mg,2次/周;中剂量组每次rhTNFR:Fc 37.5mg,1次/周;高剂量组每次rhTNFR:Fc50.0mg,1次/周,3组患者均每周用甲胺蝶呤(MTX)10mg。所有患者均于治疗前后不同时间点(0、4、8、12周)进行相关检查,包括疾病活动度量表-28(DAS28)、视觉模拟量表(VAS)评分,红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸抗体(CCP)检测,并观察治疗前后3组患者关节功能相关指标变化情况评价疗效。结果治疗前后3组患者关节功能相关指标检测结果比较,差异有统计学意义(P<0.01);治疗不同时间患者关节功能相关指标检测结果比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论选用rhTNFR:Fc治疗RA能有效改善患者症状和体征,但应根据实际临床情况、治疗目标、治疗成本选用剂量和治疗周期。

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗难治性类风湿关节炎的临床疗效观察

目的:探讨重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)治疗难治性类风湿关节炎的临床疗效。方法:50例难治性类风湿关节炎(refractory or resistant rheumatoid arthritis,RRA)随机分为治疗组25例和对照组25例。治疗组:益赛普25mg,皮下注射,每周2次,疗程6个月;对照组:安慰剂25mg,皮下注射,每周2次,疗程24周。疗效评价采用美国风湿病学会(ACR)疗效评定标准。结果:治疗组ACR20、ACR50、ACR70有效率均高于对照组(P<0.05),治疗组24周ACR20、ACR50、ACR70的有效率高于治疗组4周(P<0.05);治疗组发生不良事件6例(24.0%)高于对照组3例(12.0%)。结沦:rhTNFR:Fc治疗难治性类风湿关节炎有较好的疗效。

多发性肌炎并肺间质病变血清蛋白质组学研究

目的寻找可预测多发性肌炎(PM)及合并肺间质病变(ILD)发生、发展的血清蛋白质。方法收集PM、PM+ILD患者及正常人(对照组)各3例,用双向电泳分离血清蛋白质点。凝胶经考马斯亮兰染色后,采用Analysis 2D7.0软件进行分析,光密度差异(ratio)>2且差别具有统计学意义(P<0.05)的蛋白质点为差异表达蛋白。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行鉴定;ELISA方法进行验证。结果通过2-DE图谱分析发现,15个差异表达蛋白质点,质谱鉴定出9种蛋白质。与对照组比较,PM组表达上调的蛋白为血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A1、凝集素、血清白蛋白;PM组表达下调的蛋白为转铁蛋白(TRF);PM+ILD组表达下调的蛋白为锌-a2-糖蛋白、TRF、a2-H2-糖蛋白、a1-β-糖蛋白。与PM组比较,PM+ILD组表达下调的蛋白为TRF、β2-糖蛋白1。ELISA进一步验证显示,TRF在各组间表达差别无统计学意义(P>0.05)。结论 PM组、PM+ILD组及对照组3组间存在8种差异表达的蛋白,这些蛋白可能是PM及ILD发病的相关蛋白,参与了疾病的进程。

融合蛋白质在微生物疫苗制备中的研究进展

融合蛋白质是利用重组DNA技术将两个或两个以上不同基因的编码序列克隆在一起,表达出一个单一的多肽。这种新型的融合蛋白质在蛋白质工程中,特别是在疫苗的研究和开发上发挥了重要的作用。本文就融合蛋白质在微生物疫苗制备中的研究进展进行综述。

山萘黄素是一种有效的体外重组人蛋白激酶CK2的抑制剂(英文)

目的 为了筛选蛋白激酶CK2的抑制剂,观察山萘黄素对重组人蛋白激酶CK2的抑制效果及其酶动力学机制。方法 利用基因工程技术进行克隆、表达和纯化,获得重组人CK2的α′及β亚基在体外等摩尔混合构成CK2全酶,通过测定转移到CK2底物上的[γ32 P]ATP的32 P的放射性活性来检测CK2的活性。向反应体系中加入不同浓度的山萘黄素,观察其对CK2的抑制效果;通过固定酪蛋白浓度为2g·L- 1 ,ATP浓度为1 0 ,2 0 ,4 0和80 μmol·L- 1 或固定ATP的浓度为1 0 μmol·L- 1 ,改变酪蛋白浓度( 1 ,2 ,4和8g·L- 1 ) ,观察其酶动力学机制。结果 山萘黄素能显著抑制重组人蛋白激酶CK2的活性(IC50 =1 .9μmol·L- 1 )。抑制作用强于已知的CK2抑制剂白杨素、桑色素和金雀异黄素。酶动力学分析表明,山萘黄素与ATP(Ki=1 .1 μmol·L- 1 )及酪蛋白(Ki=3 .1 μmol·L- 1 )均呈非竞争性抑制CK2的活性。初步的化合物结构分析表明,2′和3位上的羟基对山萘黄素及芹黄素发挥其抑制效果产生实质性的负面影响。结论 山萘黄素是一种新的体外蛋白激酶CK2的有效抑制剂。黄酮类CK2的抑制剂可能通过不同的位点作用于CK2 。

重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对不同分枝杆菌致敏豚鼠的皮试反应研究

目的研究重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对临床常见致病分枝杆菌及常见环境分枝杆菌致敏豚鼠的皮试反应。方法以鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏加分枝杆菌、龟分枝杆菌脓肿亚种、偶发分枝杆菌、草分枝杆菌、微黄分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌与卡介菌等16株菌株的活菌菌液分别经腹股沟皮下攻击豚鼠,每组5只,3～4周后,分别皮内注射TB-PPD、PPD-B和重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白各0.1ml,于注射后24、48h观察局部硬结的纵径与横径,根据48h的反应结果进行判定。结果PPD-B对16种分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮试硬结直径均≥5mm,呈阳性,阳性比例均为5/5;TB-PPD对结核、牛、非洲分枝杆菌和卡介菌等活菌致敏豚鼠的皮试硬结直径均≥5mm,呈阳性,阳性比例均为5/5;重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对结核、牛和非洲分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮试硬结直径均≥5mm,呈阳性,阳性比例均为5/5;而对鸟、胞内、蟾蜍、堪萨斯、海、瘰疠、戈登、苏加、龟脓、偶发、草、微黄和卡介菌等分枝杆菌活菌、结核分枝杆菌死菌致敏豚鼠的皮试反应均呈阴性,阳性比例均为0/5。结论重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白能提高结核分枝杆菌感染诊断的特异度并能区别结核分枝杆菌是否存活、卡介菌致敏导致的皮试超敏反应。

重组腺病毒介导的HBV核心蛋白和hEDN融合蛋白基因在小鼠肝脏的表达

目的 :使HBc hEDN基因重组腺病毒载体 (AdHBc hEDN)及其对照载体AdhEDN在小鼠肝脏获得表达 .方法 :将体外扩增获得的高滴度AdHBc hEDN和AdhEDN经尾静脉注射感染小鼠 ,并用免疫组化的方法检测AdHBc hEDN和Ad hEDN在小鼠肝脏中的表达 .结果 :重组腺病毒AdHBc hEDN和AdhEDN在小鼠肝脏均获得了阳性表达 .结论 :HBc

重组结核分枝杆菌11kDa蛋白鉴别潜伏性结核感染与卡介苗接种的研究

目的评价重组结核分枝杆菌11kDa(相对分子质量为11000)蛋白(简称"重组11kDa蛋白")在潜伏性结核感染筛查和卡介苗接种鉴别中的应用。方法由首都医科大学附属北京胸科医院联合北京市昌平区结核病防治所、北京市怀柔区结核病防治所和北京市大兴区结核病防治所,于2014年7月至2016年3月在以上3个区的高校和工厂招募健康志愿者。共计招募3001名志愿者,所有志愿者体检合格,均签订知情同意书。对所有志愿者采用Mantoux法进行重组11kDa蛋白和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)同体双臂皮肤试验,分别于不同前臂皮内注射0.1ml重组11kDa蛋白(10μg/ml)和0.1ml TB-PPD(50U/ml),观察注射后72h后的皮肤反应。于皮肤试验前采集所有志愿者的静脉血,进行体外γ-干扰素释放试验(IGRA)检测。采用"一致率(%)"和"一阶一致性系数(the first-order agreement coefficient,AC1)比较重组11kDa蛋白皮肤试验、TB-PPD试验及IGRA结果的差异。3001名志愿者均接受3种方法检测,其中475名3种检测结果均为阴性的受试者,采用数字表法按随机双盲的原则,以2∶1的比例接种卡介苗(318名;失访8例)和安慰剂(147名;失访2例),接种3个月后再次进行重组11kDa蛋白皮肤试验、TB-PPD皮肤试验及IGRA,采用"一致率(%)"和"AC1"比较其结果差异。结果健康志愿者潜伏性结核感染筛查中,IGRA阳性率(34.4%,1033/3001)明显高于重组11kDa蛋白(32.2%,966/3001),差异有统计学意义(χ^2=22.787,P<0.001);IGRA与重组11kDa蛋白的一致率为93.4%(2804/3001),AC1值为0.882(95%CI=0.866~0.898),两者有较好的一致性。TB-PPD阳性率(47.7%,1430/3001)明显高于重组11kDa蛋白(32.2%,966/3001),差异有统计学意义(χ^2=182.146,P<0.001);TB-PPD与重组11kDa蛋白的一致率为60.6%(1819/3001),AC1值为0.243(95%CI=0.207~0.279),两者的一致性较差。卡介苗接种鉴别研究中,接种卡介苗的志愿者重组11kDa蛋白的阳性率(1.3%,4/318)与IGRA(3.1%,10/318)比较,差异无统计学意义(χ^2=2.571,P=0.109);一致率为95.6%(304/318),AC1值为0.954(95%CI=0.929~0.979),两者有较好的一致性。重组11kDa蛋白的阳性率(1.3%,4/318)低于TB-PPD(56.3%,179/318),差异有统计学意义(χ^2=167.350,P<0.001);TB-PPD与重组11kDa蛋白的一致率为42.5%(135/318),AC1值为0.025(95%CI=-0.106~0.155),两者的一致性较差。接种安慰剂的志愿者重组11kDa蛋白的阳性率(4.1%,6/147)与IGRA(1.4%,2/147)比较,差异无统计学意义(χ^2=2.667,P=0.109);一致率为95.9%(141/147),AC1值为0.957(95%CI=0.921~0.993),两者有较好的一致性。TB-PPD的阳性率(17.7%,26/147)高于重组11kDa蛋白(4.1%,6/147),差异有统计学意义(χ^2=15.385,P<0.001),一致率为82.3%(121/147),AC1值为0.781(95%CI=0.690~0.871),两者有较好的一致性。结论重组11kDa蛋白在潜伏性结核感染筛查和卡介苗接种方面与IGRA有很好的一致性,可作为潜伏性结核感染者筛查与卡介苗接种鉴别的候选诊断试剂。

小鼠B7-H4重组蛋白的表达及鉴定

目的:构建小鼠B7-H4胞外区基因的真核表达载体,转染酵母细胞以表达mB7-H4,并检测其生物学活性。方法:以mB7-H4的重组质粒为模板,在克隆引物上加入XhoI和EcoRI酶切位点,并用PCR方法扩增得到mB7-H4胞外区的基因片段,经XhoI和EcoRI双酶切后接入酵母表达载体Ppic9上,构建成Ppic9-mB7-H4重组质粒。经双酶切和核酸测序鉴定,将该重组质粒转染至酵母细胞,用PCR、Western Blot及ELISA等方法检测重组基因的表达,并鉴定表达蛋白的生物学活性。结果:转染Ppic9-mB7-H4重组质粒的酵母细胞内表达mB7-H4,诱导表达的mB7-H4能有效抑制CD3单抗活化的T淋巴细胞的增殖(相对抑制率为28.3%)和IL-2(相对抑制率为68.8%)、IL-4(相对抑制率为78.8%)、IL-10(相对抑制率为67.6%)、IFN-γ(相对抑制率为77.7%)等细胞因子的分泌。结论:成功构建了mB7-H4真核表达系统,并获得了有生物学活性的mB7-H4分子。

肺炎链球菌comD/E/C基因重组表达及ComD/C与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性

目的：构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统（TCS）基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化。方法：采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组蛋白rComD、rComE和rComC表达量。免疫家兔制备rComD、rComE和rComC抗血清。检测肺炎链球菌菌株ComD和ComC被抗血清封闭后对青霉素和头孢胺噻耐药性的变化。结果：与报道序列比较,所克隆的comD、comE和comC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.4%-99.3%和99.1%-100%。所构建的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-comD、E.coliBL21DE3pET42a-comE和E.coli BL21DE3pET32a-comC能有效表达目的重组蛋白rComD、rComE和rComC,其产量分别为细菌总蛋白的28%、25%和35%。rComD、rComE和rComC抗血清免疫双扩散效价分别为1∶4、1∶4和1∶8。ComD和/或ComC被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性。结论：本研究成功地构建了肺炎链球菌comD/come/comC基因原核表达系统,为深入研究感受态形成相关TCS与耐药性关系奠定了基础。ComD和ComC与肺炎链球菌对头孢胺噻耐药性有关。

结核分枝杆菌重组Mtb81蛋白抗原血清学诊断价值的研究

目的研究重组Mtb81(rMtb81)蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,寻找更有效的结核病诊断试剂。方法应用基因工程技术表达、纯化rMtb81蛋白,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测192名健康者和210例肺结核患者血清中抗结核抗体。结果 rMtb81蛋白在大肠埃希菌细胞内以包涵体形式高效表达,表达量占菌体总蛋白的30%左右,相对分子量约80.7kD,具有良好的抗原特异性。在210例结核病患者血清中,103例菌阳患者和107例菌阴患者抗rMtb81抗体的阳性率分别为37.9%和41.1%,总的灵敏度为39.5%。在192例正常人血清中,95例PPD阴性者和97例PPD阳性者抗Mtb81抗体的阳性率分别为1.1%和6.2%。结论 rMtb81蛋白可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT-6融合蛋白重组耻垢分枝杆菌对小鼠的免疫原性研究

目的评价表达Mtb Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Ag85B-ESAT-6-rM.s)在小鼠中的免疫原性。方法6周龄BALB/c小鼠经背部皮下注射1×106 CFU(colony-forming unit,菌落形成单位)的Ag85B-ESAT-6-rM.s,同时设M.s免疫组(10只)、BCG免疫组(10只)、Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫组(10只)和生理盐水组(10只)。接种免疫后1～6周,尾静脉采血,检测小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞所占百分比;免疫后6周,MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,innersalt]法检测小鼠脾淋巴细胞增殖和酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)检测脾淋巴细胞分泌γ干扰素(interferonγ,IFN-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)等细胞因子的水平。结果Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠后能够明显刺激小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞的产生,其所占百分比[(59.6±1.5)%]明显高于BCG免疫组[(48.8±2.3)%](t=12.252,P<0.05)和原始M.s免疫组[(45.7±1.6)%](t=20.166,P<0.05)。Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖指数(3.23±0.31)与BCG免疫刺激的增殖指数(2.95±0.36)相当(t=1.864,P>0.05),但其诱生IFN-γ的能力[斑点形成细胞(spotforming cells,SFC)][(167.5±36.6)SFC/106]明显高于BCG[(98.5±26.9)SFC/106](t=4.804,P<0.05)。结论Ag85B-ESAT-6融合蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达能够明显提高M.s的免疫原性,并能够刺激小鼠机体产生有利于抗Mtb感染的免疫反应,作为TB新型候选疫苗具有一定的研究前景。