重组铜绿假单胞菌分泌蛋白PA3611诱导支气管上皮细胞-间充质转化的初步观察

目的 探讨重组蛋白PA3611能否在体外使大鼠支气管上皮细胞发生上皮-间充质转化（EMT）.方法 通过DNA合成、基因扩增、载体构建、诱导表达、纯化等过程制备重组蛋白PA3611;利用CCK-8法检测PA3611刺激对支气管上皮细胞增殖的影响;镜下观察经PA3611作用后支气管上皮细胞的形态学变化;运用Western blot法和qPCR法检测支气管上皮细胞细胞E-钙粘蛋白（E-CAD）与 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平.结果 DNA测序证实成功制备重组蛋白PA3611;重组蛋白PA3611刺激能抑制支气管上皮细胞的增殖（P〈0.05）,诱导其细胞形态学发生EMT变化,抑制E-CAD表达及促进α-SMA的表达（P〈0.05）.结论 重组铜绿假单胞菌分泌蛋白PA3611可以诱导大鼠支气管上皮细胞发生EMT,其具体机制值得进一步深入探讨.

转化体qXY中外源基因表达重组蛋白PA的食用安全性评价

目的 从毒性和过敏性2个方面对转化体qXY中外源基因表达重组蛋白PA进行食用安全性评价。方法 对大肠杆菌表达重组蛋白PA和转化体qXY中植物提取蛋白PA进行等同性分析后,分别采用毒性蛋白数据库和过敏原数据库对PA蛋白氨基酸序列进行毒性和过敏性生物信息学分析,对重组PA蛋白进行模拟胃/肠液消化稳定性试验,并且采用限量法对重组蛋白PA进行小鼠急性经口毒性试验。结果 大肠杆菌表达重组蛋白PA和转化体qXY中植物表达蛋白PA的表观分子量均为55 kD,且二者均可与PA蛋白特异性抗体结合,二者均无翻译后糖基化修饰,飞行质谱分析重组PA蛋白N端1-10氨基酸残基与理论序列一致,因此认为二者具有等同性。毒性生物信息学分析未发现PA蛋白与毒性蛋白数据库中已知毒蛋白具有序列相似性,CD-1小鼠急性经口毒性试验结果显示,5 000 mg/kg·BW剂量下未产生毒性效应。过敏性生物信息学发现,PA蛋白与已知过敏原高峰淀粉酶A(Asp o 21)存在较高的序列同源性,但模拟胃/肠液消化稳定性试验结果显示,重组蛋白PA在模拟胃液和肠液中0~15 s内均迅速消化,属于极易消化,不具有潜在过敏性。结论 未发现转化体qXY中外源基因表达重组蛋白PA具有潜在毒性和过敏性,验证了该蛋白的食用安全性。

可溶性TGF-β_1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建表达人TGF—β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础. 方法:以RT—PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM—T—Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA 技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度. 结果:经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系. 结论:成功构建了重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN, 可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.

pSLX-CMV/TβRII-IgG1Fc载体的构建

目的构建表达人TGFβ1II型受体细胞外结合区和人IgG1Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础。方法以RTPCR方法扩增目的基因TβRIIIgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRIIIgG1Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pSLXCMV中,重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度。结果经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系。结论成功构建了重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径。

rt-PA静脉窦注射结合血管内技术治疗重症颅内静脉窦血栓

目的探讨重组组织血浆纤维蛋白溶酶原激活剂（rt—PA）静脉窦注射结合机械性血栓清除治疗重症颅内静脉窦血栓的效果。方法11例重症颅内静脉窦血栓患者，共进行血管内介入治疗15次；其中机械性血栓清除结合rt—PA静脉窦局部注射14例次，单纯机械性血栓清除1次；应用AngioJet导管清除血栓9次，球囊血栓清除5次，微导丝1次。进行2次血管内治疗者4例，进行1次血管内治疗7例。每次血管内治疗rt—PA用量0～15mg，平均（9．4±4．5）mg。无介入治疗并发症发生。手术均在气管插管全麻下进行，患者介入治疗前、治疗中及治疗后均进行全身肝素化治疗。结果本组11例患者接受血管内治疗时已发生意识障碍8例，其中6例已行气管插管，2例已发生脑疝；GCS3～12分，平均（8．3±2．7）分。恢复优良8例，死亡3例。存活病例MRI／MRV随访10—32个月（平均21个月），静脉窦通畅6例，部分通畅2例。无静脉窦血栓复发病例。结论重症颅内静脉血栓可危及病人的生命，常规治疗疗效差。溶栓药物局部应用结合机械性血栓清除可以快速使受累的静脉窦恢复通畅，是一种安全、有效的治疗方法。