包虫病诊断抗原分子Eg-00512的筛选、重组表达及抗原性鉴定

目的筛选细粒棘球绦虫原头蚴抗原分子Eg-00512,并进行重组表达、纯化及免疫特性鉴定,以期作为棘球蚴病特异性诊断抗原。方法对国家人类基因组南方研究中心(CHGCS)发表的细粒棘球绦虫4个不同发育阶段的表达谱数据进行差异比较分析,筛选仅在原头蚴阶段特异表达的基因Eg-00512;利用DNAStar软件包对其编码蛋白Eg-00512进行抗原表位分析;选取合适的序列片段作为目的片段,构建基因工程菌株Eg-00512/pET-24a/BL-21,经诱导表达、纯化获得重组蛋白rEg-00512。将BALB/c小鼠随机分为免疫组、佐剂对照组、PBS对照组,分别经皮下多点注射重组蛋白、PBS+弗氏佐剂和PBS,2周后加强免疫一次。分别于免疫前,第一次免疫后2、4周每组小鼠尾静脉采血,免疫后5周摘眼球法采血,采用ELISA检测各时间点血清中特异性IgG抗体水平变化;以该血清为一抗,采用Western blot分析重组蛋白的免疫反应性。结果筛选出仅在细粒棘球蚴原头蚴阶段高表达的Eg-00512基因。该基因编码203个氨基酸,分子质量单位为23ku,其抗原表位主要位于1-15、55-93、111-119、126-149、166-194和199-202氨基酸残基及其附近。成功构建基因工程菌株Eg-00512/pET-24a/BL-21,经IPTG诱导表达重组蛋白rEg-00512。重组蛋白rEg-00512纯化后免疫小鼠诱导产生特异性IgG抗体,其中免疫5周时抗体达最高水平A450值为1.807±0.767,与佐剂对照组0.111±0.014和PBS对照组0.132±0.0246比较差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot显示,该重组抗原可被免疫鼠抗血清及细粒棘球蚴原头蚴感染鼠血清识别,而不与正常小鼠血清反应。结论成功筛选并获得重组蛋白rEg-00512,该蛋白具有较好的抗原性,可作为棘球蚴病免疫诊断候选抗原。

细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-01883的克隆、表达及免疫原性分析

目的筛选细粒棘球蚴原头节抗原分子Eg-01883,并进行克隆、表达及免疫原性分析,为寻找棘球蚴病特异性诊断抗原提供依据。方法分析已发表的细粒棘球绦虫mRNA测序数据,筛选六钩蚴中不表达、原头节中高表达的抗原分子Eg-01883。提取细粒棘球蚴原头节总RNA,用RT-PCR对目的基因Eg-01883进行克隆,重组构建原核表达载体p ET28a-Eg-01883,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的重组蛋白r Eg-01883。ICR小鼠随机分为3组(每组12只),免疫组小鼠的背部皮下多点注射r Eg-01883,2周后加强免疫1次(剂量均为10μg,100μl/只);佐剂组注射福氏佐剂和PBS,空白对照组不作任何处理。分别于免疫前,首次免疫后1、2、4周每组小鼠尾静脉采血,免疫后6周进行去眼球采血。用ELISA检测3组小鼠免疫后不同时间点的血清特异性Ig G抗体水平,及细胞因子白介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平。蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白r Eg-01883的免疫原性。结果筛选出在细粒棘球蚴原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达和纯化后获得重组蛋白r Eg-01883,该蛋白主要以包涵体形式存在。ELISA检测结果显示,用纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫小鼠,可诱导产生特异性Ig G抗体,免疫组小鼠的血清Ig G抗体水平自首次免疫后1周开始上升,6周时达到最高水平(2.344±0.153),显著高于佐剂组(0.206 1±0.006)和空白对照组(0.241±0.01)(P<0.01)。首次免疫后6周,血清中的细胞因子IFN-γ和IL-4水平,免疫组分别为43.23 pg/ml和24.88 pg/ml,均显著高于佐剂组(21.77 pg/ml,13.27 pg/ml)和空白对照组(17.40 pg/ml,12.25 pg/ml)(P<0.05)。Western blotting分析结果显示,该重组蛋白r Eg-01883抗原可被His-Tag标签抗体、免疫组小鼠血清、原头节继发感染的小鼠血清识别。结论筛选获得细粒棘球绦虫原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达、纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫ICR小鼠具有较好的免疫原性。