重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白治疗类风湿关节炎疗效分析

目的观察不同剂量重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR:Fc)治疗类风湿关节炎(RA)患者的疗效,了解不同剂量、不同用法之间的优劣,为临床用药提供依据。方法将60例RA患者根据治疗方案平均分为3组(低、中、高剂量组):低剂量组每次rhTNFR:Fc 25.0mg,2次/周;中剂量组每次rhTNFR:Fc 37.5mg,1次/周;高剂量组每次rhTNFR:Fc50.0mg,1次/周,3组患者均每周用甲胺蝶呤(MTX)10mg。所有患者均于治疗前后不同时间点(0、4、8、12周)进行相关检查,包括疾病活动度量表-28(DAS28)、视觉模拟量表(VAS)评分,红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸抗体(CCP)检测,并观察治疗前后3组患者关节功能相关指标变化情况评价疗效。结果治疗前后3组患者关节功能相关指标检测结果比较,差异有统计学意义(P<0.01);治疗不同时间患者关节功能相关指标检测结果比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论选用rhTNFR:Fc治疗RA能有效改善患者症状和体征,但应根据实际临床情况、治疗目标、治疗成本选用剂量和治疗周期。

HSP-沙眼衣原体MOMP T细胞表位基因的重组、原核表达和蛋白质纯化

目的:构建热休克蛋白65(HSP65)与沙眼衣原体(C．trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(MOMP) T细胞表位(简称ctml)融合蛋白(简称H-ctml)的原核表达载体,并将其表达及纯化。方法:用PCR技术获得HSP65基因和ctml基因,并分别将其克隆入pMD18-T载体,采用酶切与连接的方法从pMD18-T载体上获得HSP65基因片段,并将其克隆入pET28a表达质粒,再用相同的方法将ctml基因连接于HSP65基因片段的下游,从而完成H-ctml的基因重组。用IPTG诱导转化H—ctml表达载体的大肠杆菌,以镍金属螯合亲和层析法纯化融合蛋白质。结果:构建了HSP65与ctml的表达载体pET28a-H—ctml,DNA序列测定结果表明构建正确。以镍金属螯合亲和层析获得纯度为98％的融合蛋白质。结论:用分子克隆技术正确构建HSP65与 Ct MOMP T细胞表位融合蛋白的表达载体,并成功表达与纯化出具有生物活性的融合蛋白。

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗难治性类风湿关节炎的临床疗效观察

目的:探讨重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)治疗难治性类风湿关节炎的临床疗效。方法:50例难治性类风湿关节炎(refractory or resistant rheumatoid arthritis,RRA)随机分为治疗组25例和对照组25例。治疗组:益赛普25mg,皮下注射,每周2次,疗程6个月;对照组:安慰剂25mg,皮下注射,每周2次,疗程24周。疗效评价采用美国风湿病学会(ACR)疗效评定标准。结果:治疗组ACR20、ACR50、ACR70有效率均高于对照组(P<0.05),治疗组24周ACR20、ACR50、ACR70的有效率高于治疗组4周(P<0.05);治疗组发生不良事件6例(24.0%)高于对照组3例(12.0%)。结沦:rhTNFR:Fc治疗难治性类风湿关节炎有较好的疗效。

融合蛋白质在微生物疫苗制备中的研究进展

融合蛋白质是利用重组DNA技术将两个或两个以上不同基因的编码序列克隆在一起,表达出一个单一的多肽。这种新型的融合蛋白质在蛋白质工程中,特别是在疫苗的研究和开发上发挥了重要的作用。本文就融合蛋白质在微生物疫苗制备中的研究进展进行综述。

重组腺病毒介导的HBV核心蛋白和hEDN融合蛋白基因在小鼠肝脏的表达

目的 :使HBc hEDN基因重组腺病毒载体 (AdHBc hEDN)及其对照载体AdhEDN在小鼠肝脏获得表达 .方法 :将体外扩增获得的高滴度AdHBc hEDN和AdhEDN经尾静脉注射感染小鼠 ,并用免疫组化的方法检测AdHBc hEDN和Ad hEDN在小鼠肝脏中的表达 .结果 :重组腺病毒AdHBc hEDN和AdhEDN在小鼠肝脏均获得了阳性表达 .结论 :HBc

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT-6融合蛋白重组耻垢分枝杆菌对小鼠的免疫原性研究

目的评价表达Mtb Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Ag85B-ESAT-6-rM.s)在小鼠中的免疫原性。方法6周龄BALB/c小鼠经背部皮下注射1×106 CFU(colony-forming unit,菌落形成单位)的Ag85B-ESAT-6-rM.s,同时设M.s免疫组(10只)、BCG免疫组(10只)、Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫组(10只)和生理盐水组(10只)。接种免疫后1～6周,尾静脉采血,检测小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞所占百分比;免疫后6周,MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,innersalt]法检测小鼠脾淋巴细胞增殖和酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)检测脾淋巴细胞分泌γ干扰素(interferonγ,IFN-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)等细胞因子的水平。结果Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠后能够明显刺激小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞的产生,其所占百分比[(59.6±1.5)%]明显高于BCG免疫组[(48.8±2.3)%](t=12.252,P<0.05)和原始M.s免疫组[(45.7±1.6)%](t=20.166,P<0.05)。Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖指数(3.23±0.31)与BCG免疫刺激的增殖指数(2.95±0.36)相当(t=1.864,P>0.05),但其诱生IFN-γ的能力[斑点形成细胞(spotforming cells,SFC)][(167.5±36.6)SFC/106]明显高于BCG[(98.5±26.9)SFC/106](t=4.804,P<0.05)。结论Ag85B-ESAT-6融合蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达能够明显提高M.s的免疫原性,并能够刺激小鼠机体产生有利于抗Mtb感染的免疫反应,作为TB新型候选疫苗具有一定的研究前景。

冻干重组结核杆菌融合蛋白(EC)原液效力评价用国家参考品的初步建立

目的以冻干重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,"EC"为重组融合蛋白"结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)"](以下简称"EC")原液为原材料,研制EC变态反应原原液效力评价用国家参考品。方法以电泳法、高效液相色谱法分别测定备选EC原液纯度,纯度合格后经精密称量、分装、冻干制成候选国家参考品,再测定其蛋白质和水分含量。将候选国家参考品稀释成不同稀释度后,皮内注射结核分枝杆菌活菌致敏的豚鼠,根据皮肤试验硬结或红晕反应平均直径大小(简称"反应平均直径大小")结果探索原液效价测定的适宜稀释度。在此基础上,将候选国家参考品用于EC原液的效价测定并进行方法验证,初步评价其适用性能。研究还初步观察了候选品在-20℃放置24个月的稳定性。结果 EC原液电泳法纯度为100.00%,高效液相色谱法纯度为95.33%,候选国家参考品蛋白质含量为508μg/瓶,水分含量为1.57%,分装精度控制在±1%以内。稀释度探索结果显示:候选品稀释度为2.5μg/ml(12.5U/ml)、5μg/ml(25U/ml)和10μg/ml(50U/ml)时剂量对数反应平均直径大小曲线有良好的线性关系(R^2=0.9944),可作为后续研究的适宜稀释度。将候选国家参考品用于EC原液效价测定,两者剂量对数反应平均直径大小曲线趋势基本一致(R^2=0.9878,R^2=0.9643),且每个稀释度EC原液与相应稀释度候选国家参考品反应平均直径大小的比值均满足1.0±0.2。方法验证结果显示:候选国家参考品和EC原液的剂量对数反应平均直径大小曲线趋势基本一致(R^2=0.9999,R^2=0.9815),且两者相应稀释度反应平均直径大小的比值均满足1.0±0.2,方法可行。初步稳定性研究结果显示:-20℃放置24个月的候选国家参考品效价测定性能稳定。结论候选国家参考品的纯度、蛋白质含量、水分含量及均匀性检测均符合国家参考品质量要求,将其稀释到适宜稀释度后可用于EC原液的效价测定;经方法验证与稳定性观察,显示其性能良好,为国家参考品申报提供了基础。

重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α分泌型真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的构建重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α的分泌型真核表达载体并检测其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的稳定表达。方法以人胚肾293细胞为材料,提取总RNA,用RT-PCR方法合成人tumstatin cDNA,将该cDNA克隆到pGEM-T载体获得重组质粒pGEM-T/tumstatin。利用PCR从pGEM-T/tumstatin和PBV220-TNF-α载体中分别扩增出sig-tumstatin-linker和linker-TNF片段,将其克隆得到sig-tumstatin-linker-TNF片段,sig-tumstatin-linker-TNF片段经酶切后,插入经同样酶切pIRESneo3质粒,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的sig-tumstatin-linker-TNF基因片段及重组载体进行验证。将重组sig-tumstatin-linker-TNF真核表达载体转染到CHO-K1对其表达状况进行检测。结果所获得的sig-tumstatin-linker-TNF片段(1.32kb)序列与报道的序列完全一致。酶切鉴定的结果表明含肿瘤抑素基因的重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF表达载体构建成功。转染重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF的CHO-K1表达了肿瘤抑素融合蛋白tumstatin-linker-TNF。从生长曲线结果来看,转染pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF真核表达载体和转染pIRESneo3的CHO-K1比未转染的CHO-K1细胞的生长速度要慢。结论成功地构建了重组人肿瘤抑素融合蛋白的真核表达载体,并获得能稳定表达人肿瘤抑素融合蛋白的CHO-K1。

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对慢性阻塞性肺疾病大鼠营养状态的影响

目的探讨重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠营养状态的影响。方法48只大鼠随机分为4组:正常对照组、COPD组、rhTNFR:Fc干预组和干预对照组。单纯吸烟法建立COPD模型,后3组烟雾暴露达1个月时,干预组给予rhTNFR:Fc进行干预,干预对照组给予空白对照制剂。熏烟80d称重后,处理所有大鼠。正常对照组、COPD组肺组织切片行HE染色观察形态学改变,定量测定肺平均内衬间隔(MLI)、平均肺泡数(MAN)。以酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组血清中的TNF-α浓度。使用自动生化分析仪测定各组大鼠血清白蛋白含量。结果①COPD组肺MLI高于正常对照组,MAN低于正常对照组(P<0.05)。②COPD组血清TNF-α浓度高于正常对照组和rhTNFR:Fc干预组(P<0.05),和干预对照组比较差异无显著性(P>0.05)。③COPD组体重较正常对照组、rhTNFR:Fc干预组体重降低,差异有显著性统计学意义(P<0.01)。rhTNFR:Fc干预组体重与干预对照组体重比较,差异有显著性统计学意义(P<0.01)。④COPD组血清白蛋白较正常对照组降低(P<0.05),但与rhTNFR:Fc干预组和干预对照组比较差异无显著性统计学意义(P>0.05)。⑤(COPD组+干预对照组)大鼠血清TNF-α浓度与体重呈负相关(r=-0.75,P<0.05),与血清白蛋白浓度呈负相关(r=-0.73,P<0.05)。结论rhTNFR:Fc可降低COPD大鼠血清TNF-α水平;rhTNFR:Fc可能对改善其营养状态具有一定作用。

重组分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32的表达及其抗原性

目的重组表达结核分枝杆菌CFP10和ESAT6的融合蛋白及卡介苗(BCG)CFP32,分析其抗原性。方法用重组PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增获得融合基因cfp10-esat6;从BCG基因组DNA中扩增cfp32基因。经克隆和测序分析后,分别亚克隆至表达载体pQE-30和pET-23a(+),在大肠埃希菌BL21中表达重组蛋白,予以纯化、鉴定,Western blot和间接ELISA分析重组蛋白的抗原性。结果构建了重组表达质粒pQE30-cfp10-esat6和pET-cfp32,表达了CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32。CFP10-ESAT6蛋白表达量约占菌体总蛋白的15.2%,纯化后蛋白纯度约为92%,浓度为0.456g/L;CFP32蛋白表达量约占菌体总蛋白的10.6%,纯化后蛋白纯度约为90%,浓度为0.310g/L。纯化CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32检测结核病的敏感性分别为85.7%和71.4%,特异性均为100%。结论重组表达获得具有良好抗原性的重组融合蛋白CFP10-ESAT6和重组蛋白CFP32。

白芍总苷胶囊联合注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白治疗幼年特发性关节炎23例及对T淋巴细胞免疫、Th1/Th2漂移及红细胞沉降率的影响

目的分析白芍总苷胶囊联合注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc,益赛普)治疗幼年特发性关节炎(JIA)病儿的临床效果及对T淋巴细胞免疫、Th1/Th2漂移及红细胞沉降率(ESR)水平的影响。方法选取2015年1月至2018年6月郑州儿童医院收治的JIA病儿46例,采用随机数字表法分为对照组与观察组每组23例,对照组单用益赛普治疗,观察组加用白芍总苷胶囊治疗,比较两组疗效,采用幼年关节炎疾病活动性评分表(JADAS27)评定病儿临床症状及体征的改善,并测定病儿治疗前后外周血T淋巴细胞免疫(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)、免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)、Th1、Th2细胞比例、Th1/Th2比值及红细胞沉降率、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的变化,统计治疗不良反应发生率。结果观察组总有效率86.96%和对照组总有效率65.22%比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗前,两组JADAS27各维度评分比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗后,观察组各维度评分降低幅度均高于对照组,JADAS27总分(11.17±0.95)分低于对照组(15.87±1.03)分(P<0.05);治疗前,两组T淋巴细胞免疫及实验室各指标比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗后,观察组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、Th2细胞比例高于对照组,IgA、IgG、IgM、Th1细胞比例、Th1/Th2比值及红细胞沉降率、TNF-α均低于对照组(P<0.05);两组治疗期间均无严重不良反应发生(P>0.05)。结论白芍总苷胶囊联合益赛普治疗JIA疗效肯定,可改善病儿临床症状及体征,调节机体免疫,改善Th1/Th2漂移,下调外周红细胞沉降率、TNF-α水平。

重组Klenow-HSA融合蛋白的构建、纯化及其稳定性

目的 :提高Klenow酶的热稳定性和储藏稳定性。方法 :利用PCR的方法扩增DH5α染色体DNA ,构建编码Klenow和人血清白蛋白第三功能区 (HSA D3)的融合蛋白表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。分别对Klenow酶和Klenow HSA融合蛋白进行纯化 ,并进行活性及稳定性的研究。结果 :发现Klenow HSA融合蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达。体外实验证实这种融合蛋白具有与Klenow聚合酶相同的活性 ,其稳定性明显提高。结论 :融合蛋白确实能增加Klenow酶的热稳定性和储存稳定性 。

重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的分离纯化工艺建立

目的建立大肠杆菌高密度表达的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(STH)分离纯化工艺。方法高密度培养重组大肠杆菌并诱导表达STH,离心收集菌体,反复冻融后收集上清液经超滤、两步阴离子交换层析,分离纯化STH目的蛋白。结果纯化后的STH纯度为98%以上,纤溶比活性2.6×104IU/mg,活性回收率56%。结论建立了STH的纯化工艺,该纯化工艺简便,时程短,重复性好,适合于大规模生产。

重组人Tum-5融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建人肿瘤抑素(tumstatin)活性片段Tum5的融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:人工合成Tum5基因,进行测序分析,将该基因克隆入原核表达载体pQE30中,转化感受态细胞DH5α,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行TricineSDSPAGE电泳分析和WesternBlot检测分析.结果构建了重组融合表达质粒pQE30Tum5,表达的蛋白经TricineSDSPAGE电泳分析,在约Mr10×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的40%,纯化后的蛋白灰度扫描检测,纯度为95%.结论:成功地构建了人Tum5基因的原核表达载体,并纯化了该基因的原核表达产物.

含人Fc重组凋亡融合蛋白体内外抗肿瘤活性初步研究

目的初步研究含人抗体Fc片段的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL-Fc)重组融合蛋白的体内外抗肿瘤活性。方法①体外实验:将人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞、人结肠癌LOVO细胞、人胃癌MKN45细胞、人表皮癌A431细胞、人肝癌HEPG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和小鼠肝癌H22细胞均随机分为TRAIL-Fc重组融合蛋白组、对照组和空白对照组,分别加入浓度为1000、250、62.5、15.6、3.9、0.97ng/ml的TRAIL-Fc重组融合蛋白和TRAIL对照品以及完全培养液,采用MTT法检测TRAIL-Fc重组融合蛋白对7种肿瘤细胞株的体外生长抑制率。②体内实验:腹腔和腋下接种H22细胞建立小鼠肝癌模型,据治疗药物的不同将小鼠随机分为空白对照组、5-Fu组和TRAIL-Fc重组融合蛋白组。测量记录腹腔接种小鼠的腹围和体重以及腋下接种小鼠的肿瘤体积,15d后取外周血处死各组小鼠,计算抑瘤率并检测血清中AST、ALT含量。结果体外实验结果显示,TRAIL-Fc重组融合蛋白对7种肿瘤细胞株的生长均有不同程度的抑制作用,且抑制作用呈剂量依赖效应;其中对MCF-7细胞的抑制作用最强,其最大生长抑制率为82.5%,其次依次为LOVO(81.9%)、MKN45(52.3%)、H22(51.2%)、Jurkat(50.9%)、HEPG2(35.4%)和A431细胞(20.3%)。与对照品相比,TRAIL-Fc重组融合蛋白对LOVO(IC50为83.5)、MKN45(IC50为243.2)、MCF-7(IC50为84.6)细胞更敏感。体内实验结果显示,空白对照组小鼠腹部明显膨出,后期体重略有下降,肿瘤体积持续显著增加;TRAIL-Fc重组融合蛋白组小鼠腹部轻微膨胀,体重维持较好,肿瘤体积后期略有增加;5-Fu组小鼠腹部无膨胀,体重急剧下降,肿瘤体积明显缩小。TRAIL-Fc重组融合蛋白的抑瘤率为45.79%,AST和ALT检测结果显示其对小鼠肝功能无明显影响。结论 TRAIL-Fc重组融合蛋白具有较强的抑制肿瘤细胞生长的能力,且在体内半衰期明显延长。

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体一抗体融合蛋白治疗急性发作强直性脊柱炎的临床疗效

[目的]评价重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(益赛普)治疗急性发作强直性脊柱炎(AS)的临床疗效.[方法]21例急性发作AS患者(男19例,女2例),益塞普每次25 mg,每周2次皮下注射,连用3个月后停药.观察患者晨僵持续时间,腰背痛和外周关节痛变化,治疗后第1、3、6及12个月红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、枕-墙距、指-地距的变化.[结果]治疗1个月后外周关节痛和腰背痛等症状显著改善,ESR由(54.41±28.21) mm /h降至(18.12±15.10)mm/h(P<0.05)、CRP由(74.30±10.26) mg/L降至(5.13±3.82) mg/L(P<0.05),治疗3个月后ESR和CRP基本降至正常.指-地距和枕-墙距在1、3、6和12个月较基线亦有明显改善.停止治疗后随访12个月,复发5例.[结论]益赛普治疗AS起效快,安全性好,本组病例5例于停药后复发,远期疗效有待继续观察.

甲氨蝶呤联合重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗严重未分化脊柱关节病的短期疗效观察

目的探索甲氨蝶呤联合重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白etanercept治疗严重未分化脊柱关节病的临床疗效和安全性。方法60例确诊为严重活动性未分化脊柱关节病的患者随机分为两组,30例作为对照组接受甲氨蝶呤(10mg,口服每周1次)联合柳氮磺吡啶(1.0,1日2次)治疗,30例接受甲氨蝶呤(10mg,口服每周1次)联合etanercept(25mg,皮下注射,每周2次)治疗。观察12周末患者的临床症状改善情况及药物不良反应。结果治疗12周末甲氨蝶呤联合etanercept治疗的患者较对照组在疼痛程度、外周关节肿胀数、BASDAI、BASFI以及CRP、ESR等临床指标上有明显改善,差异有统计学意义(P<0.05)。两组在达到BASDAI改善大于20%的患者数上差异无统计学意义(P>0.05);但etanercept组达到BASDAI改善大于50%及70%的患者数远远多于对照组(P<0.05)。etanercept组有1/3(10名)患者在停用etanercept后(平均4.2周)病情复发。两组总的药物不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。结论甲氨蝶呤联合etanercept治疗严重未分化脊柱关节病的短期疗效可能优于甲氨蝶呤联合柳氮磺吡啶治疗,且不良反应不增加,耐受性好。

具长效性重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白的理化特性研究

目的对符合制药要求的高纯度重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白原料药开展理化特性研究。方法利用基因工程技术构建了可高效表达重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白(rHSA/GCSF)的毕赤酵母工程菌,rHSA/GCSF直接分泌到组分简单的无机盐培养基中,而后经特别建立的高效分离纯化工艺进行分离纯化。通过理化分析手段,首次获得rHSA/GCSF的多项理化特性指标和结果。结果 rHSA/GCSF原料药的蛋白质纯度达到98%以上;肽质量指纹图谱匹配率为84%;N-端氨基酸序列前15个氨基酸与理论序列相符;质谱分子量测定结果为85305D,与理论分子量85215D值相近;自由巯基含量为2.4;融合蛋白经圆二色光谱分析比对表明HSA和GCSF各自的空间构象未变;等电点(pI)约为5.8;融合蛋白为非糖基化蛋白、紫外光谱呈现典型蛋白质光谱;原料药中的细菌内毒素、宿主蛋白质、外源性DNA、甲醇和甘油的残留量符合作为药物的要求。融合蛋白的免疫学鉴别为阳性;体外细胞学生物比活性测定结果值为1.5×107IU/mg,与单体rGCSF的等摩尔比没有显著差异。结论研究获得的方法和结果可作为指导《注射用重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白》原料药的质量标准和制检规程的基础。

具创新分子结构的更优长效性重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白的表达、制备和特性研究

目的研究作为药物级别重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白的生产制备工艺;开展详尽的融合蛋白理化特性研究;提出作为长效创新药物的质量基础和技术指标。方法利用基因工程技术构建1个能稳定表达全新分子结构和更优长效性的重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白(rH SA/EPO)的基因工程CHO细胞株;研究建立悬浮、无血清培养基,批次化、可线性放大的规模化生产工艺,并就分离纯化的融合蛋白进行详尽的理化特性分析。结果获得的r HSA/EPO蛋白质单体纯度达到97%以上;经不同作用位点蛋白酶水解的r HSA/EPO产物通过MALDI-TOF/TOF质谱肽质量指纹谱和Nano LC-MS/MS液质联用串联质谱检测得到总序列覆盖率100%;N-端氨基酸序列前15个氨基酸与理论序列相符;rH SA/EPO为糖基化蛋白,定位了糖基化位点;原液中融合蛋白的质谱分子量测定值为93 k D;酶深度脱糖后的质谱分子量测定结果为84205 D,与理论分子量84849.52 D值相近;融合蛋白含有1个自由巯基,表明仅有1个游离半胱氨酸存在;经圆二色光谱分析比对表明,HSA和EPO各自的空间二级构象未变;毛细管电泳测定有多个电荷异构体范围在pI 5.1~5.8,等电聚焦获得的等电点值(p I)约为p I 4.9;紫外光谱呈现典型蛋白质光谱特征;原料药中的细菌内毒素、宿主蛋白质、外源性DNA的残留量均符合药物原料药的要求。免疫学鉴别为阳性;小鼠体内生物比活性测定结果值为0.9×105 IU/mg;体外UT7细胞法与小鼠体内生物活性测定较大差异,但体内与体外生物活性测定方法可用于不同试验目的,且相互间也具有一定的相关系数。结论理化特性研究获得较为全面的药学数据,其结果可作为指导"注射用重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白(CHO细胞)"原料药的质量标准和制造检定规程的基础,并显示出原创的r HSA/EPO(之间无连接肽)具有创新性,符合作为药物的更优分子结构要求。