枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的重组表达及应用研究进展

为了解决对人类健康和粮食安全构成重大风险的抗生素耐药性威胁,开发新型抗菌药物势在必行。枯草芽孢杆菌所产的抗菌脂肽不易使细菌产生广泛的耐药性且无任何副作用,被认为是最具潜力的抗菌剂之一。但是,枯草芽孢杆菌抗菌脂肽生产成本高和生产效率低的问题严重限制了其在食品、医药、环境等工农业领域的应用,因此提高抗菌脂肽产量显得尤为重要。近几十年来,随着生物技术的快速发展,利用基因工程和优化发酵策略来生产高产量的抗菌脂肽可以克服上述问题。本文从枯草芽孢杆菌所产脂肽的结构和功能特性出发,主要从高产抗菌脂肽技术、构效关系以及应用进行综述,特别是基因工程方法提高脂肽产量的研究进展,为枯草芽孢杆菌高产抗菌脂肽的进一步研究提供参考。

类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白的重组表达及其免疫学特性研究

目的重组表达类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白,制备多克隆抗体并鉴定其免疫学性质。方法利用pET-28a表达系统在Eschericahia coli(E.coli)BL21(DE3)中重组表达BipD蛋白,通过His Trap亲和层析纯化获得rBipD蛋白,免疫BALB/c小鼠获得rBipD多克隆抗体;分别用兔抗类鼻疽菌血清和类鼻疽菌感染阳性患者血清进行Western blot实验检测rBipD的免疫反应性;通过Western blot及免疫荧光染色检测鉴定rBipD的免疫原性;以rBipD建立间接ELISA检测临床类鼻疽患者血清抗体。结果成功构建pET-28a-BipD重组质粒并转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达、纯化获得了相对分子质量约为36×10^(3)的rBipD蛋白,纯度约为95.4%。rBipD蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。免疫小鼠可产生特异性抗体,制备鼠抗rBipD多克隆抗体,效价达1∶512000。5.0μg/mL rBipD蛋白可与类鼻疽患者血清发生免疫反应,而不与结核患者血清发生免疫反应,差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功制备了具有免疫学活性的rBipD蛋白及其多克隆抗体,为其用于临床免疫学诊断和类鼻疽菌感染免疫机制研究提供了良好的工具。

葡聚糖蔗糖酶在食品级乳酸菌中重组表达

为研究葡聚糖在乳酸菌中的合成情况以及结构分析,本研究将葡聚糖蔗糖酶DsrB与带有SP45分泌信号肽的乳酸乳球菌表达载体pNZ8148质粒载体进行连接,电转入乳酸乳球菌NZ9000中进行异源表达。经由一系列醇沉、三氯乙酸去除蛋白质、二次醇沉、透析以及纯化等步骤得到多糖溶液。采用高效液相色谱法检测单糖组成;利用HPSEC测定葡聚糖的分子量;通过傅里叶红外技术、核磁共振技术以及扫描电镜分析多糖的结构并观察多糖表面特征。结果表明,将葡聚糖蔗糖酶在乳酸菌中进行表达,在蔗糖浓度为10%的条件下,葡聚糖产量为10.54 g/L;单糖组成显示仅含有葡萄糖一种单糖;胞外多糖分子量测定结果为2.4×10^(6) Da;由傅里叶红外和核磁联合表明体外合成的胞外多糖仅含有α-(1,6)糖苷键;扫描电镜表示胞外多糖表面呈现为多孔状结构。在乳酸菌中异源表达,实现了葡聚糖的食品级生产,为葡聚糖于食品中应用提供了理论基础。

屋尘螨过敏原Der p 1在毕赤酵母中的重组表达与纯化

基于巴斯德毕赤酵母表达系统探讨了屋尘螨过敏原Der p 1的重组表达与纯化。首先,采用毕赤酵母GS115表达密码子优化的全长编码基因PreProDer p 1,其产量可达100 mg/L,进一步共表达分子伴侣实现产量提高到140 mg/L,并实现3 L反应器发酵产量提高到1 g/L。其次,对上述重组蛋白发酵液分别使用阳离子交换层析及亲和层析进行了纯化工艺优化,目的蛋白得率达到60.7%。本研究为后续PreProDre p 1诊断试剂盆的开发提供了参考。

乳铁蛋白的重组表达系统及法规管理现状概述

乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白,广泛存在于哺乳动物的乳汁和黏膜分泌物当中。乳铁蛋白具有广谱抑菌、抗病毒、免疫调节等生理功能,在婴幼儿配方乳粉、营养补充剂、化妆品等领域都有应用。近年来,随着基因工程技术的不断发展,来自不同物种的乳铁蛋白在常见的原核体系、真核体系与转基因哺乳动物中均得到了成功表达,重组产物的表达量及其与天然乳铁蛋白的结构相似度也在不断提升。该文对乳铁蛋白的生物学活性、重组表达系统以及目前的法规管理情况进行综述,并讨论了重组乳铁蛋白的研究难点和未来发展方向。

鸢尾素在大肠杆菌中的重组表达及纯化

目的在大肠杆菌中重组表达并纯化得到高产量、高纯度的鸢尾素(Irisin)重组蛋白,为后续Irisin的功能研究奠定基础。方法对Irisin基因CDS序列密码子优化后进行基因合成,通过一步克隆连接法构建重组质粒pET-30a-Irisin,将其转化到大肠杆菌表达感受态细胞Rosetta(DE3)中。以终浓度为0.5 mM的IPTG在15℃、100 rpm诱导表达30 h。诱导表达结束后收集菌体,超声波破碎细菌细胞,离心取上清,用Ni-IDA琼脂糖纯化树脂进行纯化。结果成功构建得到重组质粒pET-30a-Irisin,重组表达菌株经低温、低浓度IPTG诱导,经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂纯化得到产量为105 mg·L^(-1)的高纯度Irisin重组表达产物。结论密码子和诱导条件优化可促进Irisin重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,为研究其对不同肿瘤细胞的影响及机制奠定坚实基础。

豇豆血红蛋白Lb Ⅱ在大肠杆菌中的重组表达条件优化、纯化与鉴定

豇豆根瘤中含有大量豆血红蛋白。该蛋白是良好的天然色素,可用于人造肉的着色,本文将携带豇豆血红蛋白Lb Ⅱ基因的质粒p ET-15b转化进入大肠杆菌BL21中表达,并对表达条件进行优化。通过查找NCBI数据库得到一条全长456 bp的豇豆血红蛋白Lb Ⅱ的序列,以p ET-15b作为表达载体,大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-R-IL作为重组工程菌进行表达,成功表达出豇豆血红蛋白Lb Ⅱ,并使用镍柱层析对蛋白进行初步纯化,同时添加抗坏血酸为抗氧化剂。以IPTG浓度、温度、时间为自变量,Lb Ⅱ表达量为因变量进行单因素实验。结果表明,在IPTG终浓度为1.0 mmol/L、诱导温度为25℃,时间为14 h时,重组豆血红蛋白Lb Ⅱ的表达量最高,经SDS-PAGE凝胶电泳和可见光光谱分析法鉴定为目的蛋白Lb Ⅱ。经响应面试验优化后,表达量可以达到7.30μg/m L。本研究为后续使用工程菌发酵生产豆血红蛋白奠定了基础。

别藻蓝蛋白β亚基基因在莱茵衣藻中重组表达及其对光能传递的影响研究

为了探究别藻蓝蛋白与类囊体膜光合系统之间的光能传递规律,及其与异源类囊体膜光合系统之间光能转移的可能性,本研究构建了含有钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)的别藻蓝蛋白β亚基基因(apcB),及合成藻蓝胆素的血红素氧化酶基因(ho)和铁氧还蛋白氧化还原酶基因(pcyA)的转化载体pHyg3-apcB-ho-pcyA,利用玻璃珠转化法将其导入莱茵衣藻中。聚合酶链式反应筛选验证阳性转化藻株,Southern Blot结果表明基因apcB、ho、pcyA成功转化入莱茵衣藻基因组中。而后将转化藻株与对照藻株均置于高光(50μmol·m^(-2)·s^(-1))和低光(25μmol·m^(-2)·s^(-1))条件、白光和绿光条件中培养,并检测别藻蓝蛋白β亚基的表达、总叶绿素含量、77 K低温荧光、光系统表观电子传递效率、生物量变化。结果显示:实时定量PCR分析和Western Blot检测表明外源基因apcB,pcyA和ho均在转基因藻株Cr-ApcBHP中得到了转录表达。高光和低光条件下光系统Ⅱ(PSⅡ)和光系统Ⅰ(PSⅠ)位置处的荧光峰均显著高于对照莱茵衣藻藻株CC-849,绿光中PSⅡ荧光峰(波长为690 nm)显著高于对照藻株;高光与低光和白光与绿光条件下转基因藻株的光系统Ⅱ的表观电子传递速率(ETRPSⅡ)值均高于对照藻株,但生物量并未见明显提高。这些结果表明转基因莱茵衣藻中可能存在自重组别藻蓝蛋白到光系统核心的光能传递,但是吸收的光能没有达到促进生物量积累的作用。本研究为利用重组表达蓝藻藻胆蛋白提高异源类囊体膜的光合作用进行了尝试。

人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的多拷贝重组表达、鉴定及抗氧化活性分析

胶原蛋白在人体内有重要作用,并且在食品、保健品、医疗等方面有广泛应用。该研究针对毕赤酵母的密码子偏好性对人源Ⅲ型胶原蛋白基因进行了密码子优化,在此基础上构建了人源Ⅲ型胶原蛋白单串联、二串联和二串联四拷贝表达载体pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2和pPIC9K-COL3-4,转化毕赤酵母GS115实现了人源Ⅲ型胶原蛋白的整合表达,获得了胶原蛋白单串联、胶原蛋白二串联和胶原蛋白二串联四拷贝的毕赤酵母工程菌株。对pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2重组菌株进行了摇瓶模拟高密度发酵,甲醇诱导浓度为0.5%,经SDS-PAGE和Western Blot检测,重组菌株成功表达了重组胶原蛋白,其中单串联蛋白表观分子量约为26.7 ku,双串联蛋白表观分子量约为52.3 ku。四拷贝重组菌株在0.5%甲醇诱导下的高密度摇瓶发酵产量最高,在最佳诱导时间为72 h时,蛋白产量达到约0.45 g/L。通过镍柱纯化后获得高纯度重组蛋白,抗氧化活性实验表明,重组胶原蛋白DPPH自由基清除率达到51.49%、ABTS自由基清除率达到41.24%,证明具有抗氧化活性,为其在食品,保健品和医疗领域的应用提供理论依据。

枯草芽胞杆菌重组表达的Pantoea dispersa UQ68J蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖的研究

异麦芽酮糖是蔗糖的同分异构体,具有多种优秀的生理功能,广泛应用于食品行业。蔗糖异构酶可以将蔗糖异构为异麦芽酮糖,与其他微生物来源的蔗糖异构酶相比,Pantoea dispersa UQ68J来源的蔗糖异构酶转化蔗糖时异麦芽酮糖产率高,副产物少。为了更好地将异麦芽酮糖应用于食品领域,该研究将P.dispersa来源的蔗糖异构酶在食品安全微生物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中重组表达,研究重组蔗糖异构酶的酶学性质并优化其制备异麦芽酮糖的反应条件。结果表明,重组酶的最适pH值为6.0,最适温度为30℃,在pH 5.0~8.0稳定性良好,在45℃下的半衰期为68 min。用该重组酶制备异麦芽酮糖,当蔗糖质量浓度为400 g/L,加酶量为20 U/g,在30℃、pH 6.0条件下转化10 h时,异麦芽酮糖产率可达90.61%,当蔗糖质量浓度提高到700 g/L,异麦芽酮糖产率仍可达89.20%。该研究提高了蔗糖异构酶的安全特性,实现了异麦芽酮糖的高产率,为工业生产异麦芽酮糖奠定了基础。

赖氨酰内切酶在大肠杆菌中的重组表达、复性及纯化

首先在产酶溶杆菌来源的赖氨酰内切酶(Lys-C)成熟肽序列的N端和C端分别融合人工前肽(MGSK)和6×His标签,将密码子优化后的序列插入表达载体pET-28a;其次以IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导型启动子PT7控制Lys-C的高效表达,并针对重组菌株JM109DE3_PT7-LysC开展生物反应器高密度发酵生产Lys-C;再次收集和溶解包涵体得到Lys-C变性液,通过Sephadex G25层析脱除DTT(二硫苏糖醇),并在Lys-C复性液中添加前导肽(pre-N-pro)辅助成熟肽蛋白折叠;进一步通过切向流过滤、Ni NTA-Sepharose亲和层析和Sephacryl S-100层析等一系列纯化步骤,获得高纯度的重组Lys-C;最后进行酶切三肽底物和门冬胰岛素前体检测,分析重组Lys-C的活性水平。结果表明:重组Lys-C的发酵产量为2.4 g/L,经复性和纯化后的终产量可达48 mg/L;添加80 mg/L pre-N-pro促进了重组Lys-C的复性,复性后酶活相比于未添加pre-N-pro时提升了4.8倍,最高可达到13.8 U/L;经过多步纯化后,重组Lys-C的比酶活为10.2 U/mg,且对于门冬胰岛素前体的酶切转化率可达93.5%。

钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆、分析及重组表达蛋白荧光活性的研究

为探究蓝藻藻胆体核心色素蛋白-别藻蓝蛋白单个亚基的光学活性和功能,本研究克隆了钝顶节旋藻(Arthrospira platensis FACHB314)中的脱辅基别藻蓝蛋白基因apcAB及其亚基基因apcA和apcB。节旋藻基因组中apcAB全长共1056 bp,由apcA和apcB串联组成,中间间隔84 bp。其中,apcA和apcB基因的全长均为486 bp,且均编码161个氨基酸,预测分子量分别约为17.39和17.33 kDa,它们分别编码的α和β亚基均属于Globin_like超级家族,系统进化树分析显示其氨基酸序列在蓝藻和节旋藻中较为保守。将克隆出的亚基基因apcA、apcB分别同前期A.platensis FACHB314中获得的藻蓝胆素合成相关基因ho和pcyA以及色基裂合酶基因(cpcE、cpcF、cpcU、cpcS、cpcT)共同转化至大肠杆菌中,获得重组别藻蓝蛋白亚基菌株E.coli HPEFUSTA、E.coli HPEFUSTB。SDS-PAGE和Western Blot均显示重组菌株中已成功表达别藻蓝蛋白单亚基。荧光检测结果显示,在600 nm波长激发下,两株重组菌株在640 nm处均出现了别藻蓝蛋白特征荧光发射峰。这些结果表明在重组大肠杆菌中表达的脱辅基别藻蓝蛋白的单亚基可以和藻蓝胆素结合,形成有光学活性的别藻蓝蛋白,这为研究蓝藻中藻胆体的组装和功能提供有效的元件,为别藻蓝蛋白在医药、荧光检测方面的应用奠定了基础。

分散泛菌胞内脱乙酰酶在大肠杆菌中重组表达条件优化及酶学特性

目的 对分散泛菌的胞内脱乙酰酶(PantoeadispersaN-acetylglucosaminedeacetylase,Pd-nagA)进行表达条件优化及酶学性质分析。方法 本研究使用聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)技术对分散泛菌全基因组中Pd-nagA基因序列进行全长扩增,将含有Pd-nagA基因的质粒pET-28a(+)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,同时采用单因素实验,优化诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)的浓度,采用Ni2+-次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid, NTA)进行重组酶的纯化,再对其酶学特性进行测定。结果 以pET-28a(+)质粒作为表达载体,大肠杆菌BL21(DE3)成功表达了可溶形式的Pd-nagA蛋白,分子量约为40kDa。当诱导温度为28℃,诱导前菌液OD600值为1.2, IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导时间为20 h时, Pd-nagA蛋白得到了大量表达。通过薄层层析法分析表明Pd-nagA重组蛋白能够在体外转化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖,Pd-nagA重组蛋白能够在高盐溶液中保持一半的相对酶活性,该酶4℃储存10d的相对活性仍然保持在90%以上,具有良好的储存稳定性,催化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖反应条件简单快捷。结论 本研究成功异源表达了具有催化活性的Pd-nagA酶,并对表达条件进行优化及酶学特性探究,可为工业上单酶催化制备氨基葡萄糖提供一定的理论参考。

液化沙雷氏菌ZS6脂肪酶的重组表达及功能分析

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)在日常生活及工业生产中涉及油脂处理的方面有着广泛应用。课题组前期从舟山海域石油污泥中筛选出1株分泌脂肪酶的菌株,经分子鉴定后确定为液化沙雷氏菌,将其命名为液化沙雷氏菌ZS6。ZS6菌株脂肪酶分泌量较低,因此采用大肠杆菌表达体系对ZS6脂肪酶进行重组表达。使用pET28a质粒作为重组蛋白表达载体,通过IPTG诱导大肠杆菌表达脂肪酶蛋白。表达产物经纯化—复性—冻干处理后得到脂肪酶结晶,经分光光度法测得活性达到1400 U·mg^(-1)。该研究结果可以应用于固定化脂肪酶的制备以及脂肪酶的工业化生产。

中国明对虾溶菌酶基因克隆、重组表达与性质分析

溶菌酶是机体先天免疫系统中一个重要的效应分子,参与机体多种免疫反应,在溶菌过程中形成一个水解体系,破坏和消除侵入体内的病原,从而实现机体的免疫防御。从中国明对虾中克隆得到了溶菌酶基因(称为FcLyz基因),该基因全长709bp,其完整的阅读框为477bp,编码158个氨基酸,前18个氨基酸(-1^-18)为信号肽,成熟肽由140个氨基酸组成(1-140aa),其分子量为16.2kD。经SMART分析,该基因具有1个溶菌酶1(LYZ1)结构域(19-130aa)。半定量RT-PCR分析结果表明溶菌酶虽在多种组织中有较低水平的组成性表达,但在细菌诱导的血细胞、心脏、肝胰腺和鳃等多种组织中表达上调。将中国明对虾溶菌酶基因的成熟肽亚克隆进原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),再进行诱导表达和亲和纯化,得到了纯化的重组溶菌酶,并进行了抑菌活性检测。结果表明,重组对虾溶菌酶对革兰氏阳性菌的抑菌能力较强,最小抑菌浓度达到3.43μmol/L,但对革兰氏阴性菌抑制作用较小。上述结果表明,该溶菌酶作为一种重要的免疫效应分子,参与了对虾的免疫防御反应。

乳铁蛋白的理化性质及其重组表达系统的研究进展

乳铁蛋白(Lactoferrin,Lf)是分子量大小约为80 k Da的铁离子结合糖蛋白,是转铁蛋白(Transferrin,Tf)家族的成员之一。其理化性质独特,具有抑菌、抗病毒、抗癌、免疫调节、调节铁离子的吸收等诸多生物学功能。获得高产且有生物活性的重组乳铁蛋白,并用于临床治疗,一直是研究热点。随着基因工程技术的发展,已获得多个可表达重组乳铁蛋白的表达系统。本文对乳铁蛋白的理化性质、生物学活性、临床研究以及目前的重组表达系统进行综述,以期为乳铁蛋白的临床应用提供参考。

大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)在大肠杆菌中的重组表达及活性鉴定

利用基因重组技术,克隆了大豆(Glycinemax(L.)Merr.)的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)全基因,构建pET-GMPAL工程表达质粒,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,并利用细胞裂解液得到的粗酶液转化L-苯丙氨酸生成肉桂酸。通过8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,获得了分子量在77.9kD的一条蛋白质特异表达带,特异蛋白质表达量达到总蛋白质含量的8%左右。通过初步发酵,获到具有PAL活性的粗酶液裂解液,粗酶的比活力达到211.7μmol/gpro·min(3529μkat/kg),高于红酵母PAL和欧芹重组PAL表达的比活力。结果表明克隆重组的大豆PAL基因通过表达质粒pET-GMPAL在E.coli中能高效地表达为有催化功能的高活力酶。

布氏杆菌BCSP_(31)/pVAX1重组表达质粒的构建及其免疫保护效果的研究

目的构建布氏杆菌BCSP31/pVAX1重组表达质粒,免疫BALB/c小鼠,观察其免疫应答及免疫保护效果。方法克隆BCSP31基因,构建BCSP31/pVAX1重组表达质粒。转染COS7细胞,免疫组化检测其BCSP31蛋白抗原的表达。BCSP31/pVAX1重组表达质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,观察特异性体液免疫和细胞免疫效果。进一步用1.25×104布氏杆菌A544强毒株腹腔攻毒,观察BCSP31/pVAX1重组表达质粒的免疫保护效果。结果扩增的BCSP31保护性抗原基因片断在牛、羊和猪布氏杆菌株中具有高度保守性,构建的BCSP31/pVAX1重组表达质粒在COS7细胞有目的蛋白抗原的表达。制备的BCSP31/pVAX1重组表达质粒肌肉免疫BALB/c小鼠4次,ELISA检测BCSP31/pVAX1重组表达质粒产生了较高水平的特异性IgG抗体,并随免疫次数增加抗体的滴度也递增,且抗体亚型以IgG2a为主,表明主要引起Th1型的免疫应答。FCM检测BCSP31/pVAX1重组表达质粒的CD4+/CD8+比值明显下降,说明激发了显著的CTL效应。MTT测定BCSP31/pVAX1重组表达质粒的淋巴细胞增殖能力与对照组比较差异显著。布氏杆菌A544强毒株攻毒后,动物存活及脾组织细菌数与对照组比较有显著性差异,说明BCSP31/pVAX1重组表达质粒能够产生有效的保护效果。结论研制的BCSP31/pVAX1重组表达质粒免疫BALB/c小鼠能产生高水平的特异性体液免疫和细胞免疫,以细胞免疫为主,并产生有效的免疫保护效果,为布氏杆菌病新型疫苗的研究奠定了基础。

HIV蛋白质优势B细胞抗原表位的筛选、重组表达与抗原性鉴定

设计了一种新的病原体蛋白质B细胞抗原表位的筛选和重组表达方法。不须使用抗原 ,而通过交替用病人血清IgG抗体“淘洗”(biopanning)随机肽库和用正常人血清IgG反向吸附 ,来获得特异抗原表位资料。用HIV病人血清的IgG抗体淘洗噬菌体递呈随机十二肽库 ,再以正常人IgG抗体吸附 ,筛选到了能和HIV病人血清发生特异反应的噬菌体克隆 ,经ELISA、DNA测序等 ,成功地筛选出了位于HIVgp41外膜蛋白、高亲和力、构型特异的优势B细胞抗原表位 ( 60 2 GCSGKLICTTNV61 3)。用大肠杆菌硫氧还蛋白作为骨架 ,在其活性部位以“内融合”形式重组表达了该抗原表位 ,纯化的重组蛋白具有良好的抗原性 ,能与HIV( + )IgG抗体及艾滋病人血清呈特异反应 ,表明本技术路线可以有效地进行HIV蛋白质的B细胞抗原表位筛选和重组表达。此方法也可移植于其它病原微生物抗原或自身抗原的表位研究 ,继而为基于抗原表位水平的特异诊断试剂的研制、疫苗的设计提供依据。

结核分枝杆菌保护性肽表位KLIANNTRV多聚体重组表达及鉴定

目的重组表达结核分枝杆菌保护性肽表位KLIANNTRV二聚体、四聚体、八聚体,以进一步探讨其免疫效应。方法选取结核分枝杆菌抗原表位KLIANNTRV,引入Th表位PADRE及木马肽序列(RKKRRQRRR),并以RVKR序列作为接头,分别合成结核分枝杆菌保护性肽表位KLIANNTRV二聚体、四聚体、八聚体全基因序列,经PCR扩增后分别插入融合表达载体pGEX-4T-1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达,进一步经GST亲合层析柱纯化,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组表达蛋白。结果成功构建了结核分枝杆菌保护性表位KLIANNTRV二聚体、四聚体、八聚体的表达质粒,并经IPTG诱导表达了大小约为20000、32000、54000的融合蛋白。结论结核分枝杆菌保护性肽表位KLIANNTRV多聚体的重组表达为进一步开发结核疫苗提供有价值的依据。