含油酸培养基培养对重组解脂耶氏酵母全细胞催化合成反10,顺12-共轭亚油酸的影响

亚油酸异构酶(PAI)在解脂耶氏酵母细胞内成功表达,以添加外源c9,c12-亚油酸(c9,c12-LA)为底物,全细胞催化合成反10,顺12-共轭亚油酸(trans10,cis12-conjugated linoleic acid,t10,c12-CLA)。解脂耶氏酵母在分别含0.0(对照组)、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/L油酸的培养基中生长,收集菌体转移至磷酸盐缓液中进行全细胞催化,比较各组菌体的t10,c12-CLA产率,含5.0 g/L油酸组产物产率最高,达到1.34 g/g,是不含油酸组的1.4倍左右。通过PAI酶活分析及Western blot检测PAI表达量,结果表明,培养基中油酸含量越高,重组解脂耶氏酵母的PAI表达量越低;对比不含油酸组和含5.0 g/L油酸组全细胞催化不同时间的t10,c12-CLA产量,含5.0 g/L油酸组t10,c12-CLA产量最高点的时间比不含油酸组提前约20 h;透射电子显微镜观察2组的菌体状态,含5.0 g/L油酸组细胞壁和细胞膜间隙扩大,该变化可能增加了全细胞催化过程中底物和产物进出细胞的速率,从而提高t10,c12-CLA的转化效率。

重组解脂耶氏酵母生产谷氨酰胺转胺酶酶原的发酵优化

谷氨酰胺转胺酶(EC2.3.2.13,TGase)是一种重要的食品酶,广泛应用于食品组分的质构、起泡性及乳化性等功能性质的改善。以一株分泌谷氨酰胺转胺酶酶原(pro-TGase)的重组解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica BBETG为研究对象,结合单因素实验与正交实验对其发酵培养基进行优化,以期实现pro-TGase的高产。结果表明,较优的发酵培养基配方为:甘油15 g/L、酵母膏20 g/L、氯化铵2.64 g/L、KH2PO4 0.32 g/L、无水MgSO4 0.25 g/L、VB13.34×10-4 g/L,初始pH值8.0。在该培养基中,重组菌于28℃发酵120 h,获得的pro-TGase经体外活化,酶活达8.47 U/mL,较初始发酵培养基产量提高393%。

外源底物亚油酸对解脂耶氏酵母重组菌株合成共轭亚油酸的影响

为了提高解脂耶氏酵母重组菌株的反-10,顺-12-共轭亚油酸(t10,c12-CLA)产量,采用YNBDL培养基进行摇瓶发酵,考察了在培养基中添加不同纯度的亚油酸对解脂耶氏酵母合成t10,c12-CLA的影响。结果表明:亚油酸纯度的提高对菌株的生长和产脂未产生影响,且t10,c12-CLA的产量随亚油酸纯度的增加而提高,最高产量可达3.7 g/L;用大豆油替代培养基中的亚油酸,t10,c12-CLA的转化率从20%提高至25%,菌株生长、产脂及t10,c12-CLA产量与添加纯度为65%亚油酸的结果相近。实验证明解脂耶氏酵母重组菌株能够高效转化富含亚油酸的植物油合成t10,c12-CLA。

代谢工程构建重组耶氏解脂酵母生产中长链聚羟基脂肪酸酯

中长链聚羟基脂肪酸酯(mcl-PHA)是一大类由微生物合成的天然生物聚酯,因具有可再生性和生物降解性越来越受到人们的关注。Mcl-PHA可由一些假单胞菌类利用自身的脂肪酸合成途径或β-氧化途径来合成。耶氏解脂酵母具有很好的脂/脂肪酸分解代谢能力,但是它体内缺乏PHA合成酶不能合成mcl-PHA。采用代谢工程策略构建重组解脂酵母,外源表达来自铜绿假单胞菌PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1)的PHA合成酶。在PHA合成酶的C端添加PTS1过氧化物酶体定位信号序列,使其在过氧化物酶体内发挥功能,并对其编码基因Pha C1进行密码子优化得到o Pha C1。利用p INA1312载体构建表达框,借助载体上的zeta序列元件将o Pha C1基因表达框整合至酵母基因组,完成基因的稳定表达。重组菌PSOC在葡萄糖为唯一碳源的培养基中几乎不产PHA,添加0.5%的油酸时可合成占细胞干重0.67%的mcl-PHA。在含三油酸甘油酯的培养基中发酵72h产生1.51%mcl-PHA(wt%)。实验结果充分证明重组解脂酵母作为有潜力的微生物细胞工厂可以用于生产mcl-PHA,也为将来利用富含油脂和其他营养的餐厨垃圾水解液等廉价资源生产mcl-PHA打下基础。