人呼吸道合胞病毒转录调节基因转染肺腺癌细胞系的研究

目的 获得稳定表达人呼吸道合胞病毒(h RSV) M2 - 1基因的人肺腺癌细胞系。方法 通过基因重组法构建h RSV M2 - 1基因真核表达载体,用脂质体将其转染人肺腺癌PAa和A5 4 9细胞,经G4 18筛选获得阳性表达细胞株,并用逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR)和Western Blot进行验证。结果 得到了约6 5 0 bp的基因插入片段,DNA测序表明该基因高度保守。筛选出了稳定高量表达M2 - 1基因的PAa和A5 4 9细胞,并被证实有M2 - 1蛋白表达。结论 获得了稳定表达h RSV M2 - 1蛋白的PAa和A5 4

低剂量辐射联合pEgr-P16基因治疗诱导食管癌细胞凋亡的研究

目的:研究大剂量(2Gy)和低剂量(0.075Gy)X射线诱导pEgr P16重组质粒稳定转染的食管癌细胞株EC9706凋亡的作用。方法:将脂质体包裹的pEgr P16重组质粒,转染食管癌细胞系EC9706中,经G418筛选,获得稳定表达的细胞;采用Westernblot方法检测不同剂量X射线诱导后P16的表达;观察不同剂量X射线照射后,EC9706细胞凋亡率的变化。结果:pEgr P16重组质粒转染EC9706细胞,并获得稳定转染的细胞;2Gy和0.075GyX射线照射均可诱导P16表达增强;稳定转染的细胞经2Gy和0.075GyX射线照射,细胞凋亡率明显高于假照射(0Gy)组(P<0.05～0.01)。结论:0.075GyX射线照射可诱导稳定转染的EC9706细胞中P16表达增强,使诱导细胞凋亡率提高。

重组DNA甲基化酶1表达质粒对结肠癌细胞相关基因表达的影响

目的 分析DNA甲基化酶 1(DNMT1)基因的真核表达质粒对人结肠癌细胞肿瘤相关基因的表达影响。方法 分别构建并转染含有人正义和反义DNMT1的真核表达质粒入结肠癌SW 1116细胞 ,PCR和限制性内切酶证实转染结果 ,以Western印迹法分析各组细胞DNMT1蛋白的表达情况。定量PCR检测hMLH1、hMSH2及c myc、p16 INK4A 基因的表达。结果 经G4 18筛选得到稳定转染DNMT1基因的结肠癌细胞系 ,且分别在该转染有正义和反义质粒的细胞系中 ,DNMT1蛋白表达上调和下调。同时发现转染正义DNMT1的细胞中hMLH1、hMSH2及c myc的表达降低 ,而转染反义DNMT1的细胞中hMSH2的表达明显增强。各组细胞p16 INK4A基因的表达差异不明显。

人的类硫氧还蛋白还原酶活性的测定及其对细胞凋亡的影响

在对人的类硫氧还蛋白基因(hTRXL)进行了Northern印迹法鉴定的基础上表达了该基因产物,并对hTRXL蛋白的功能进行了研究,hTRXL胰岛素还原酶活性实验显示全长hTRXL和其N端结构域(hTRXL-N)都具有胰岛素还原酶活性;C端区域(hTRXL-C)不具有胰岛素还原酶活性,将含有hTRXL基因的重组质粒转染乳癌细胞系MCF-7,该细胞对于药物引起的细胞凋亡较未转染hTRXL的MCF-7对照细胞更为敏感。

组织因子/活化因子Ⅶ复合物影响人卵巢癌细胞侵袭及转移能力的研究

目的 研究组织因子 /活化因子Ⅶ (TF/FⅦa)复合物对人卵巢癌细胞体外侵袭能力及体内转移能力的影响。方法 ①采用分子克隆及基因转染技术构建高效表达TF的人卵巢癌细胞系A2 780 /TF ;②采用Boyden小室法计数FⅦa刺激后A2 780、A2 780 /TF穿透Matrigel迁移到PVPF膜背面的细胞数 ;③建立人卵巢癌细胞转移的实验动物模型 ,研究TF对人卵巢癌细胞在裸鼠体内形成转移灶的能力。结果 ①经分子克隆技术构建得到pcDNA3 TFcDNA重组体 ;②稳定转染的A2 780 /TF细胞内TFmRNA水平显著增高 :转染细胞为 3.99± 0 .15 ,未转染细胞为 0 .97± 0 .2 3(P <0 .0 1) ;转染细胞表面TF表达也显著增高 :转染细胞中约 (48.5 6± 9.5 3) %细胞表面有TF抗原 ,而未转染细胞中仅 (2 .73± 1.15 ) % (P <0 .0 1) ;③A2 780 /TF细胞穿膜细胞数为 15 7.3± 19.2 ,经FⅦa刺激后穿膜细胞数显著增多 ,为 4 4 7.7± 39.4 (P <0 .0 1) ;与FⅦa和抗TF单抗共孵育的A2 780 /TF ,穿膜细胞数接近刺激前的基础水平 ;④种植A2 780细胞的裸鼠中 2 2 .2 %可见肺部转移灶 ,种植A2 780 /TF细胞的裸鼠中 88.9%发生肺转移 (P <0 .0 1)。结论 ①将所构建的TF真核表达载体转入人卵巢癌细胞系 ,获得稳定、高效表达TF的人卵巢癌细胞系A2 780 /TF 。

KAI1基因抗胰腺癌细胞转移的研究

目的 将pCMV KAI1重组质粒转染入人高转移胰腺癌细胞株PANCⅠ和MiaPaCaⅡ中 ,观察转染前后KAI1基因对胰腺癌细胞增殖能力的影响 ,探讨KAI1基因抗胰腺癌转移的调控作用。方法 通过脂质体转染法将 pCMV KAI1重组质粒成功转染到人胰腺癌细胞株PANCⅠ和MiaPaCaⅡ中 ,采用MTT比色法、细胞集落形成和流式细胞术 (FCM )测定细胞增殖活力和生长周期的变化。结果 pCMV KAI1重组质粒转染PANCⅠ和MiaPaCaⅡ人胰腺癌细胞株后 ,细胞增殖能力较转染前分别降低 4 0 .5 9%和 6 5 .84 % (P <0 .0 5 )。转染KAI1基因的细胞集落形成率 (14 .0 0 % )较转染前 (4 9.5 6 % )明显减少 (P <0 .0 1)。转染后比转染前胰腺癌细胞数量在G0 /G1期明显增加 (PANCⅠ细胞由 4 0 .97%± 1.34%增加到 6 5 .36 %± 1.2 3% ,MiaPaCaⅡ细胞由 2 4 .10 %± 1.0 0 %增加到 4 3.18%± 1.0 6 % ) ,M/G2 期数量降低 (PANCⅠ从 2 1.4 6 %± 0 .96 %降至 13.35 %± 0 .2 2 % ,MiaPaCaⅡ由 2 4 .89%± 1.14 %降至 19.0 6 %± 0 .5 7% ) ,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论 KAI1基因控制胰腺癌细胞转移可能是通过改变胰腺癌细胞的生长周期 ,抑制癌细胞的增殖及分裂功能来实现的。

Survivin shRNA表达质粒的构建、转染和筛选

我们采取基因静寂策略，利用psiRNA—hHlneo载体，以SurvivinmRNA为靶序列，构建在细胞内产生短发夹状RNA（shRNA）的重组质粒，观察其对胆囊癌细胞株GBC—SD的抑制作用。