细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31在根癌农杆菌LBA4404中的表达效率研究

目的分析细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31在根癌农杆菌LBA4404株中的表达效率。方法用IPTG诱导根癌农杆菌0、1、3、5、7、9、11和13h,用SDS-PAGE和Western blot鉴定所表达的蛋白质。结果表达产物分子质量单位约为37.5ku,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别,表达蛋白约占LBA4404菌体总蛋白的20%。结论细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31能在LBA4404中表达,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础。

细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95构建及其在根癌农杆菌LBA4404中表达效率的研究

目的:构建细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95,分析其在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,At)LBA4404株中的表达效率。方法:从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因,将该基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95重组质粒;电穿孔转化A(tLBA4404),抽提质粒进行酶切及PCR鉴定。用IPTG分别诱导rAt0、1、3、5、7、9、11和13h,用SDS-PAGE和Western blot鉴定所表达的蛋白质。结果:471bpEg95基因克隆成功。经酶切及PCR证实重组质粒pBI-Eg95成功转入A(tLBA4404)。用Bio-Rad Quantity one分析系统分析,表达产物分子质量(Mr)约为16.5kD,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别,表达效率为约占LBA4404菌体总蛋白的20%。结论:成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95,且能在A(tLBA4404)中表达,为进一步研究细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础。

细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒构建及鉴定

目的构建并鉴定细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒。方法从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA为模板,采用RT-PCR方法分别扩增Eg95和EgA31编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)扩增Eg95-EgA31融合基因;将该融合基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95-EgA31重组质粒;电穿孔转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,At)LBA4404株,抽提质粒进行酶切及PCR鉴定。结果电泳及测序证实1 016bpEg95-EgA31融合基因克隆成功。经酶切及PCR证实重组质粒pBI-Eg95-EgA31成功转入根癌农杆菌。结论成功构建了细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础。

细粒棘球绦虫重组pCD-Eg95质粒构建及鉴定

目的:构建并鉴定细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)重组pCD-Eg95质粒。方法:从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因,将该基因定向克隆到真核表达载体pCDNA3.1中构建pCD-Eg95重组质粒;电穿孔转化大肠杆菌BL21(DE3)株,抽提质粒进行酶切及PCR鉴定。结果:电泳及测序证实471bpEg95基因克隆成功。经酶切及PCR证实重组质粒pCD-Eg95成功转入BL21(DE3)。结论:成功构建了Eg重组pCD-Eg95质粒。

新城疫病毒B_(95)株HN蛋白基因的克隆及序列分析

根据 NDV HN蛋白已知基因序列设计一对引物 ,以提取的澳大利亚布里斯班 NDV分离株 B95基因组 RNA为模板 ,利用 RT- PCR技术扩增得到一条约 1.9kb的条带。将扩增产物克隆到 PGEM- T- easy载体中 ,并对重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,结果证明我们得到了 HN基因的阳性重组子 ,随后采用 Sanger's双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定 ,获得该基因全长序列 ,并进行同源性分析。 B95株与其他毒株核苷酸同源性为 95 .1%～ 87% ,氨基酸同源性为96 .1%～ 92 .1%。

细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95-EgA31的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95-EgA31,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎细粒棘球蚴组织,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得Eg95和EgA31抗原编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)剪接Eg95和EgA31,得到Eg95-EgA31融合基因,克隆至原核表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Eg95-EgA31,转化大肠埃希菌BL21,经异丙基硫代--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Westernblot对表达产物进行分析和鉴定。结果基因拼接法扩增出约1 016 bp的Eg95-EgA31融合基因;双酶切证实Eg95-EgA31融合基因成功插入pGEX-1λT中,SDS-PAGE分析显示表达产物为分子质量单位约为62.5 ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的18%;Western blot鉴定重组蛋白能被细粒棘球蚴感染鼠血清识别。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95-EgA31,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。

细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95的构建及其在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

目的构建细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,并研究该质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎细粒棘球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增Eg95抗原编码基因;克隆至原核表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Eg95;转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出471 bp的Eg95抗原编码基因;双酶切证实Eg95抗原编码基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约42 500的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的21%;Western blot鉴定显示重组蛋白能被细粒棘球蚴感染鼠血清识别。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,该质粒在大肠杆菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。