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结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达效率的研究 被引量:1
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作者 谢婷 李文桂 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2008年第3期173-175,177,共4页
目的构建结核分枝杆菌(MTB)重组质粒pGEX-ESAT-6,分析ESAT-6抗原在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达效率。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到ESAT-6抗原编码基因;将该基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST... 目的构建结核分枝杆菌(MTB)重组质粒pGEX-ESAT-6,分析ESAT-6抗原在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达效率。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到ESAT-6抗原编码基因;将该基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的高效原核表达载体pGEX-1λT,经酶切鉴定后以IPTG诱导表达ESAT-6/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。结果PCR扩增出288bp的ESAT-6基因;双酶切证实ESAT6基因成功插入pGEX-1λT中,构建了pGEX-ESAT-6穿梭表达载体。SDS-PAGE分析重组质粒pGEX-ESAT-6表达产物的分子质量单位为35ku,表达效率为20%,Western blot检测该蛋白能被活动性结核病人血清特异识别。结论结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6在大肠埃希菌中获得了高效融合表达,表达的ESAT-6重组蛋白具有抗原特异性。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 重组质粒pgex-esat-6 大肠埃希菌 表达效率
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结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT-6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定 被引量:3
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作者 陈玮 鲍朗 +4 位作者 谢勇恩 胡昌华 张万江 李学敏 张会东 《华西医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期35-39,共5页
目的 构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白 ESAT- 6的重组卡介苗。方法 分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增得到约 117bp的 BCGα抗原 (α- Ag)信号肽序列和 2 85 bp的结核杆菌 esat- 6基因序列... 目的 构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白 ESAT- 6的重组卡介苗。方法 分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增得到约 117bp的 BCGα抗原 (α- Ag)信号肽序列和 2 85 bp的结核杆菌 esat- 6基因序列。将 esat- 6基因与大肠杆菌 -卡介苗穿梭质粒载体 p MV2 6 1重组 ,得到重组质粒 p ME。再将 BCGα- Ag信号肽序列克隆至 p ME中 ,得到重组质粒 p SME。结果 质粒 p SME用双酶切和 PCR扩增鉴定证实 ,克隆基因 α- Ag信号肽序列和 esat- 6正确插入载体 p MV2 6 1。结论 重组质粒 p SME可望在 BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白 ESAT- 6 ,该质粒的构建成功为改造卡介苗。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ESAT-6 基因重组 穿梭质粒 PCR 基因扩增
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p21激活的磷酸化蛋白激酶6基因克隆、重组质粒载体的构建和序列分析
3
作者 李俊 黎剑 +5 位作者 张宏权 罗荣城 张丽媛 林晓卿 袁建梅 韩宇晶 《广东医学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第9期1410-1412,共3页
目的测定PAK6在前列腺癌中的表达,探讨PAK6与前列腺癌的关系。方法根据人全长PAK6cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板利用PCR技术克隆PAK6全长cDNA。在此基础上,进行DAN序列测定。结果成功克隆了PAK6全长cDNA,构建了pGEX-... 目的测定PAK6在前列腺癌中的表达,探讨PAK6与前列腺癌的关系。方法根据人全长PAK6cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板利用PCR技术克隆PAK6全长cDNA。在此基础上,进行DAN序列测定。结果成功克隆了PAK6全长cDNA,构建了pGEX-4T-1-PAK6-NT重组质粒载体并进行了序列测定。结论克隆PAK6全长cDNA并进行了序列测定,为深入探讨PAK6在前列腺癌中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 PAK6 基因克隆 重组质粒载体 序列 前列腺癌
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HPV16和11型L1基因双价重组质粒的构建
4
作者 庄敏 谷鸿喜 +2 位作者 魏兰兰 肖鹏 孔卫兰 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2003年第2期60-60,共1页
关键词 HPVl6 Ll基因 双价重组质粒 构建 人乳头瘤病毒 HPV11型
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HCBP6模拟磷酸化重组质粒的构建与亚细胞定位
5
作者 杨雪亮 王雯 +5 位作者 吴文娟 刘小静 李卫敏 叶峰 成军 蔺淑梅 《中国肝脏病杂志(电子版)》 CAS 2022年第1期27-33,共7页
目的构建HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的绿色荧光蛋白重组质粒,明确其亚细胞定位。方法以构建含有570 bp的HCBP6外显子基因的绿色荧光蛋白重组质粒为基础,应用快速定点突变技术构建HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒。将重组质粒测... 目的构建HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的绿色荧光蛋白重组质粒,明确其亚细胞定位。方法以构建含有570 bp的HCBP6外显子基因的绿色荧光蛋白重组质粒为基础,应用快速定点突变技术构建HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒。将重组质粒测序并进行序列比对。利用jetPRIME转染体系将HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒转染至细胞中,应用Real-Time PCR技术检测目的基因mRNA的表达,应用Western blot技术检测目的基因蛋白表达,应用荧光显微镜观察HCBP6不同位点磷酸化质粒的亚细胞定位。结果将测序的重组序列与目的基因进行比对,发现重组序列与目的基因完全一致,说明HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒构建成功。Real-Time PCR和Western blot表明,与对照组相比,实验组高表达HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的基因。免疫荧光显微镜可见10Ala主要在细胞质表达,WT、10Asp、151Ala、151Asp主要在细胞核表达。结论构建的HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒可成功转染细胞并在细胞中高表达,HCBP6不同位点磷酸化质粒亚细胞定位不同。 展开更多
关键词 HCBP6 重组质粒 模拟磷酸化 亚细胞定位
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重组Psilencer1.0-U6-siRNA-stat3质粒对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞的影响 被引量:1
6
作者 孙江滨 赵科研 +2 位作者 李博 吴慧颖 柳克祥 《中国老年学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第22期2921-2922,共2页
目的观察重组Psilencer1.0-U6-siRNA-stat3质粒对大鼠主动脉平滑肌细胞(RSMCs)的抗增殖作用机制。方法应用组织块方法培养RSMCs,应用脂质体转染方法将重组Psilencer1.0-U6-siRNA-stat3质粒转染体外培养的RSMCs,利用相差显微镜、MTT比色... 目的观察重组Psilencer1.0-U6-siRNA-stat3质粒对大鼠主动脉平滑肌细胞(RSMCs)的抗增殖作用机制。方法应用组织块方法培养RSMCs,应用脂质体转染方法将重组Psilencer1.0-U6-siRNA-stat3质粒转染体外培养的RSMCs,利用相差显微镜、MTT比色法观察体外培养的RSMCs增殖情况。结果培养72h后,相差显微镜下观察可见重组质粒组细胞增殖明显减少,MTT检测可见重组质粒组RSMCs的抑制率明显高于对照组。结论重组Psilencer1.0-U6-siRNA-stat3质粒能够抑制RSMCs增殖。 展开更多
关键词 主动脉平滑肌细胞 STAT3 重组Psilencer1.0-U6-siRNA-stat3质粒
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分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗的构建和表达 被引量:5
7
作者 刘洪波 吴少庭 +2 位作者 蔡昌学 甘燕 秦莉 《热带医学杂志》 CAS 2006年第10期1064-1067,共4页
目的构建分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗。方法PCR扩增结核分枝杆菌热休克蛋白60(hsp60)的调控序列和合成T4转录终止序列,分别定向克隆入pBCG2000载体的多克隆位点的上下游,得到E.coli-Mycobacterium穿梭载体质粒pBCG3000。PC... 目的构建分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗。方法PCR扩增结核分枝杆菌热休克蛋白60(hsp60)的调控序列和合成T4转录终止序列,分别定向克隆入pBCG2000载体的多克隆位点的上下游,得到E.coli-Mycobacterium穿梭载体质粒pBCG3000。PCR分别扩增出结核分枝杆菌分泌性抗原Ag85B的全编码序列及ESAT-6基因,然后将两基因融合插入pBCG3000载体的hsp60启动子下游得到pBCG3000-85B-ESAT-6分泌性表达质粒。用电穿孔法将pBCG3000-85B-ESAT-6质粒转化BCG细胞,得到重组卡介苗。重组卡介苗经热诱导后,SDS-PAGE电泳和Westernblotting鉴定融合蛋白85B-ESAT-6的表达及其免疫学活性。结果通过PCR、酶切以及测序鉴定,pBCG3000-85B-ESAT-6表达质粒构建完全正确,SDS-PAGE电泳未能直接观察到表达的融合蛋白条带,用ESAT-6蛋白的多抗血清通过Westernblotting证实了该蛋白主要分泌性表达于胞外并具有免疫学活性。结论分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗构建成功。 展开更多
关键词 融合蛋白 AG85B ESAT-6 重组卡介苗 穿梭质粒
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表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究 被引量:5
8
作者 李岩 鲍朗 +2 位作者 张会东 李娅莎 朱海龙 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第7期923-926,共4页
目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV-ESAT6,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,用电穿孔法将... 目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV-ESAT6,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc2155中。以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组(P<0.05)。结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础。 展开更多
关键词 ESAT-6 大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒 重组耻垢分枝杆菌 巨噬细胞
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结核CFP10/ESAT6抗原和人GM-CSF基因重组卡介苗的构建与免疫原性研究 被引量:1
9
作者 杨晓玲 邓仪昊 +2 位作者 夏志扬 黄丹丹 鲍朗 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第A10期2030-2030,共1页
关键词 免疫原性研究 CFP10/ESAT6 基因重组 免疫反应 血清特异性 重组穿梭质粒 重组质粒 融合基因 定向克隆 周达
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结核分枝杆菌三种基因重组质粒的构建及原核表达 被引量:1
10
作者 丁淑琴 师志云 +2 位作者 董辉 杨风琴 朱佳佳 《检验医学与临床》 CAS 2013年第4期388-389,391,共3页
目的构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白。方法将目的基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2。结果成功构建基因工程菌株ESAT-6... 目的构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白。方法将目的基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2。结果成功构建基因工程菌株ESAT-6、CFP10、phoS2/pET-28a/BL21(DE3)plysS,表达重组蛋白ESAT-6、phoS2,因以包涵体形式存在,无法纯化。结论成功构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a重组质粒,分别表达分子量约10×103、31×103的ESAT-6、phoS2重组蛋白,但无法纯化,CFP10不表达。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ESAT-6 CFP10 phoS2 重组质粒 原核表达
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乙肝病毒前S/S抗原的重组表达质粒对HBV转基因小鼠的免疫治疗效应 被引量:2
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作者 周陶友 陈敏 +5 位作者 赵连三 王松 陈守春 何芳 刘丽 唐红 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2005年第7期844-847,共4页
目的:观察重组表达质粒pcDNA3.1-S2S和pcDNA3.1-S1S2S对HBVDNA复制和抗原表达的抑制效果.方法:以能表达乙肝表面抗原主蛋白S(HBsAg)的重组真核表达质粒为骨架,构建了分别含有HBV前S1抗原和/或前S2抗原编码基因的pcDNA3.1-S1S2S,pcDNA3.1... 目的:观察重组表达质粒pcDNA3.1-S2S和pcDNA3.1-S1S2S对HBVDNA复制和抗原表达的抑制效果.方法:以能表达乙肝表面抗原主蛋白S(HBsAg)的重组真核表达质粒为骨架,构建了分别含有HBV前S1抗原和/或前S2抗原编码基因的pcDNA3.1-S1S2S,pcDNA3.1-S2S,并各以100μg肌肉接种C57BL/6HBVDNA转基因小鼠,2,4wk后各加强免疫1次.然后动态检测小鼠血清HBVDNA水平的变化、抗-HBs和前S2抗体的诱生,以及肝组织内HBsAg、前S2抗原的消长情况.结果:小鼠肝组织内HBsAg,前S2抗原呈逐渐减弱的趋势,8wk后各有1/3的小鼠已不能检出.pcDNA3.1-S1S2S组接种后4,8,12wk抗-HBs阳转率分别为50%、67%、100%,明显高于pcDNA3.1-S2S组(17%、33%、50%)(P<0.05);而前S2抗体阳转率均低于17%.接种后8wk,12wk,pcDNA3.1-S1S2S组和pcDNA3.1-S2S组小鼠血清HBVDNA水平明显下降,均低于自身接种前、接种后4wk以及同期对照组(P<0.05).结论:重组表达质粒pcDNA3.1-S2S和pcDNA3.1-S1S2S接种,能够抑制转基因小鼠体内的HBV复制,而重组质粒中S1基因的共表达使抑制作用得到增强. 展开更多
关键词 重组表达质粒 HBV转基因小鼠 治疗效应 乙肝病毒 pcDNA3 S抗原 HBV前S1抗原 抗-HBS阳转率 前S2抗原 表面抗原主蛋白 C57BL/6 DNA水平 血清HBV HBsAg 真核表达质粒 DNA复制 前S2抗体 抗体阳转率 HBV复制 接种后 抑制效果
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利用同源重组技术构建Hoxa5、BMP6真核表达载体及共转染成纤维细胞表达
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作者 李晶 张梦瑶 +2 位作者 刘开东 柳楠 贺建宁 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2020年第4期187-194,共8页
旨在利用同源重组构建敖汉细毛羊Hoxa5、BMP6基因表达载体及共转染成纤维细胞后通过基因表达量变化研究两基因之间的相互作用关系。以敖汉细毛羊为研究对象,采集30日龄的胎羊。首先,通过RNA的提取反转录成cDNA参照GenBank中Hoxa5、BMP6... 旨在利用同源重组构建敖汉细毛羊Hoxa5、BMP6基因表达载体及共转染成纤维细胞后通过基因表达量变化研究两基因之间的相互作用关系。以敖汉细毛羊为研究对象,采集30日龄的胎羊。首先,通过RNA的提取反转录成cDNA参照GenBank中Hoxa5、BMP6基因序列和pcDNA3.1序列分别设计1对含有同源臂的引物,通过PCR反应扩增获得Hoxa5、BMP6基因片段、利用SoSo试剂盒将目的片段连接到pcDNA3.1真核表达载体上。鉴定构建pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMP6重组表达载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的质粒pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMP6共转染至成纤维细胞,采用RT-PCR技术和Western Blot技术检测Hoxa5、BMP6基因单转染和共转染在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示:经酶切、测序鉴定质粒pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMP6构建成功,并且共转染成纤维细胞Hoxa5基因的表达量极显著下降,BMP6基因的表达量极显著升高且共转染组的表达量极显著地高于单转染组(P<0.01)。利用同源重组技术成功构建了敖汉细毛羊Hoxa5、BMP6基因的表达载体,并且成功共转染成纤维细胞,BMP6基因的表达量升高,Hoxa5基因的表达量极显著下降,因而初步推断基因BMP6抑制了Hoxa5基因的表达,相反地Hoxa5基因促进了BMP6基因的表达,结果可为进一步研究其功能奠定基础。 展开更多
关键词 同源重组 成纤维细胞 Hoxa5、BMP6质粒共转染 RT-PCR Western Blot
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含EMC6基因重组真核表达载体的构建及其在人肝L-02细胞中的异位表达
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作者 Syed Hameed Ali Shah 何大伟 +2 位作者 何敖林 李莎莎 王炳芳 《江苏大学学报(医学版)》 CAS 2017年第6期466-469,共4页
目的:构建pcDNA3.1(+)/EMC6真核表达载体,并将其在人肝L-02细胞株中过表达。方法:查询Pub Med上EMC6的基因序列,针对该序列设计引物,提取L-02细胞的总RNA、聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段,采用基因重组技术将EMC6的cDNA定向插入真核... 目的:构建pcDNA3.1(+)/EMC6真核表达载体,并将其在人肝L-02细胞株中过表达。方法:查询Pub Med上EMC6的基因序列,针对该序列设计引物,提取L-02细胞的总RNA、聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段,采用基因重组技术将EMC6的cDNA定向插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建pcDNA3.1(+)/EMC6真核表达载体,经菌落PCR,测序验证构建的准确性。应用脂质体转染方法将重组载体转入L-02细胞中,RT-PCR、蛋白质印迹法检测EMC6基因的mRNA和蛋白表达水平。结果:PCR和基因测序结果均表明pcDNA3.1(+)/EMC6重组质粒构建成功,RT-PCR和蛋白质印迹检测结果证实EMC6在人肝L-02细胞中过表达。结论:成功构建人pcDNA3.1(+)/EMC6重组质粒,并在L-02细胞中过表达。 展开更多
关键词 内质网膜蛋白复合体亚基-6 重组质粒 载体构建 转染 L-02细胞
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小鼠TRAF6基因shRNA真核表达载体的构建与表达 被引量:5
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作者 陈锋 何生松 +3 位作者 邱荣元 庞然 许娟娟 董继华 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2009年第14期1406-1411,共6页
目的:构建并筛选肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)短发夹RNA(shRNA)表达质粒.方法:针对小鼠TRAF6 mRNA设计4条理论上最佳的siRNA序列,经退火成互补双链,将相应双链DNA插入pGCsi-U6/GFP/Hygro质粒中,构建重组表达质粒pGCsi-TRAF6-shRNA1... 目的:构建并筛选肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)短发夹RNA(shRNA)表达质粒.方法:针对小鼠TRAF6 mRNA设计4条理论上最佳的siRNA序列,经退火成互补双链,将相应双链DNA插入pGCsi-U6/GFP/Hygro质粒中,构建重组表达质粒pGCsi-TRAF6-shRNA1,2,3,4,并以不同比例DNA质粒/脂质体转染重组质粒(1∶2、2∶5、1∶3和1∶4)至RAW264.7细胞中,观察转染效果.结果:靶向TRAF6 mRNA的4个shRNA重组质粒载体pGCsi-TRAF6 shRNA1,2,3,4,经测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,证实载体构建成功.应用荧光显微镜分析转染效率显示,DNA(g)/脂质体转染重组质粒(L)按1∶2、2∶5、1∶3和1∶4比例转染细胞的效率分别为13.7%±1.2%、24.5%±2.1%、19.3%±1.7%、16.3%±2.8%,以2∶5为最佳比例.只加了脂质体未加质粒(试剂对照)的细胞无荧光表达.结论:TRAF6靶向RNA干扰重组表达质粒构建成功,为进一步研究阻断TRAF6表达对急性肝衰竭过度炎症反应的基因治疗奠定基础. 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子受体相关因子6 RNA干扰 重组表达质粒 短发卡RNA
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结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化 被引量:3
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作者 温见翔 吴少庭 +8 位作者 陈群 秦莉 袁仕善 林绮萍 雷明军 潘晖榕 张仁利 高世同 黄达娜 《中国热带医学》 CAS 2004年第6期897-899,925,共4页
目的 构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。 方法 用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性... 目的 构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。 方法 用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a(+ ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。 结果 从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。 结论 利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 ESAT-6 ET 结核分枝杆菌 原核表达系统 结核病 蛋白 纯化 重组表达质粒 阳性克隆 IPTG
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HPV 6b L1基因原核表达系统的构建及鉴定 被引量:2
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作者 刘希君 庄敏 +4 位作者 商庆龙 王燕 魏兰兰 李迪 谷鸿喜 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2005年第4期25-27,共3页
克隆、构建人乳头瘤病毒6b型(HPV6b)L1基因重组质粒,并进行表达和鉴定。用PCR方法,从尖锐湿疣标本中扩增出HPV6b型L1基因,构建重组克隆质粒pblue-HPV6bL1,测序分析其基因变异。将本地株HPV6b型L1基因酶切后连接到原核表达质粒pBAD,构建... 克隆、构建人乳头瘤病毒6b型(HPV6b)L1基因重组质粒,并进行表达和鉴定。用PCR方法,从尖锐湿疣标本中扩增出HPV6b型L1基因,构建重组克隆质粒pblue-HPV6bL1,测序分析其基因变异。将本地株HPV6b型L1基因酶切后连接到原核表达质粒pBAD,构建原核表达系统pBAD-HPV6bL1/Top10,酶切鉴定证明重组质粒的正确性。经L-Arobinose诱导后表达HPV6b型L1蛋白,利用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。经酶切及序列分析鉴定,重组质粒pBAD-HPV6bL1构建成功,诱导后能够表达L1融合蛋白。HPV6bL1重组质粒构建成功,并获得HPV6bL1蛋白,为该蛋白的功能及HPV的基因工程疫苗研究提供了物质基础。 展开更多
关键词 尖锐湿疣 人乳头瘤病毒6b型 L1基因 基因克隆 基因表达 原核表达系统 酶切鉴定 质粒构建 HPV 基因重组质粒
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低剂量电离辐射在C57BL/6J小鼠肿瘤基因-放疗方案中的作用 被引量:1
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作者 武宁 张海玉 +1 位作者 金顺子 刘树铮 《辐射防护》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期193-196,249,共5页
为探讨低剂量电离辐射在C57BL/6J小鼠肿瘤基因-放疗方案中的作用,对荷瘤小鼠采用不同的治疗方案(单纯多次大剂量局部照射、单次大剂量局部照射加多次低剂量全身照射、pEgr-IL18-B7.1基因联合放疗),观察其对肿瘤重量、全肺表面转移结节... 为探讨低剂量电离辐射在C57BL/6J小鼠肿瘤基因-放疗方案中的作用,对荷瘤小鼠采用不同的治疗方案(单纯多次大剂量局部照射、单次大剂量局部照射加多次低剂量全身照射、pEgr-IL18-B7.1基因联合放疗),观察其对肿瘤重量、全肺表面转移结节数以及肿瘤间质微血管密度的影响。结果显示,采用单纯放疗和基因-放疗与对照组相比均能显著降低肿瘤重量、全肺表面转移结节数和肿瘤间质微血管密度;单纯放疗方案中应用单次大剂量局部照射加多次低剂量全身照射与单纯多次大剂量局部照射相比,在降低治疗剂量的同时,能达到相近似的抑瘤效果。在基因-放疗方案中,基因导入联合单次大剂量局部照射后加多次低剂量全身照射的治疗效果明显优于联合应用常规多次大剂量局部照射。提示低剂量电离辐射可以通过减轻肿瘤负荷、减少肿瘤远处转移和抑制肿瘤间质血管形成,增强基因-放疗方案的抑瘤作用。 展开更多
关键词 低剂量电离辐射 C57BL/6J小鼠 pEgr-IL18-B7.1重组质粒 基因-放疗
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人乳头瘤病毒11型早期蛋白E6和E7基因的克隆及序列分析 被引量:1
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作者 王飞 王群 +3 位作者 毕志刚 李光富 王新军 张兆松 《中国麻风皮肤病杂志》 2005年第2期81-84,共4页
目的:从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒11型(HPV11)早期蛋白E6、E7基因,并进行序列测定及编码氨基酸序列分析,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础。方法:用PCR法,从CA标本中扩增出HPV11E6、E7基因,与载体pGEX-6P-1连接... 目的:从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒11型(HPV11)早期蛋白E6、E7基因,并进行序列测定及编码氨基酸序列分析,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础。方法:用PCR法,从CA标本中扩增出HPV11E6、E7基因,与载体pGEX-6P-1连接成重组质粒pGEX-6P-1E6、pGEX-6P-1E7,酶切鉴定及双脱氧法测序观察其变异状况。结果:克隆出HPV11早期蛋白E6、E7基因,成功构建重组质粒pGEX-6P-1E6、pGEX-6P-1E7。本研究克隆出的HPV11E7基因与GenBank标准株序列完全相同,E6基因有两个位点的变化。结论:本研究克隆出的HPV11E6、E7基因与标准株基本相同,这将为进一步研究E6、E7基因的表达、免疫活性及流行病学奠定基础。 展开更多
关键词 E7基因 HPV11 人乳头瘤病毒11型 早期 克隆 蛋白 重组质粒 标本 E6基因 HPV感染
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CONSTRUCTION AND IMMUNOGENICITY OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 6B L1 RECOMBINANT PLASMID 被引量:1
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作者 FangLiu Jia-biWang +2 位作者 Ya-gangZuo Yue-huaLiu Dong-laiMa 《Chinese Medical Sciences Journal》 CAS CSCD 2004年第3期233-236,共4页
To construct a DNA vaccine as a prophylactic model to prevent condyloma acuminatum and detect its immu-nogenicity in mice. Methods The major capsid protein (L1) gene of human papillomavirus (HPV) 6b was inserted into ... To construct a DNA vaccine as a prophylactic model to prevent condyloma acuminatum and detect its immu-nogenicity in mice. Methods The major capsid protein (L1) gene of human papillomavirus (HPV) 6b was inserted into an eukaryotic ex-pression plasmid (pcDNA3.1). The recombinant plasmid was transfected into COS-7 cells. Western blot were performed to detect whether L1 protein can be expressed in eukaryotic cells. Eighteen female BALB/c mice were tested for immunoge-nicity study. Results The recombinant plasmid (pcDNA3.1-HPV6bL1) was verified as HPV6b L1 gene by sequencing. Western blot showed specific strip. Anti-L1 protein antibodies could be detected in the mice’s sera inoculated with pcDNA3.1-HPV6bL1. Similarly, IL-4, IL-2, and IFN-γ were increased in the same mice. Conclusion HPV6b L1 recombinant plasmid was constructed successfully which had immunogenicity for BALB/c mice. It provided experimental evidence for the research of DNA vaccine of condyloma acuminata..- 展开更多
关键词 免疫血球素 结构组成 人类乳头瘤病毒 6B型 L1重组细胞 质粒 DNA疫苗 尖锐湿疣
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DDX6突变体的构建
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作者 周焱琳 唐翠兰 于秀芝 《浙江中西医结合杂志》 2019年第4期273-276,I0002,共5页
目的构建人源性DDX6多种突变体真核表达载体。方法以DDX6-WT为模板,利用同源重组技术构分别建出2个突变体,根据突变位置,分别命名为DDX6-EQ、DDX6-△C。结果经PCR、酶切、测序和Western Blot鉴定,构建出无解旋酶活性的DDX6-EQ和无ATP酶... 目的构建人源性DDX6多种突变体真核表达载体。方法以DDX6-WT为模板,利用同源重组技术构分别建出2个突变体,根据突变位置,分别命名为DDX6-EQ、DDX6-△C。结果经PCR、酶切、测序和Western Blot鉴定,构建出无解旋酶活性的DDX6-EQ和无ATP酶、解旋酶活性的DDX6-△C,蛋白分子量分别为54kD,34kD。结论成功构建2个突变体,为进一步研究DDX6在癌症进展过程中的调控作用奠定基础。 展开更多
关键词 DDX6 质粒构建 同源重组技术
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