重组运动发酵单胞菌HYMX发酵葡萄糖产乙醇工艺的优化

用Tn5转座技术将七个基因(Pfu-s HSP,yfd Z,met B,xyl A,xyl B,tkt A and tal B)导入到原型菌CP4中,得到重组菌HYMX;并用响应面方法优化重组菌的发酵工艺。结果表明,最佳发酵工艺条件为葡萄糖质量浓度285 g/L,初始p H值为6.5,发酵时间63 h,发酵温度32℃,接种量10%,酵母提取物10 g/L。优化后最高乙醇产量为137.11 g/L,比优化前的最高乙醇产量130.9 g/L提高了4.53%,比原型菌的72.17 g/L提高了89.98%。

真空干燥重组运动发酵单胞菌发酵剂的研制

利用重组运动发酵单胞菌制备乙醇发酵剂,研究保护剂、菌泥与保护剂比例、复合保护剂以及真空干燥条件等因素对菌体存活率的影响。实验结果表明,单一乳糖对重组运动发酵单胞菌的保护效果最佳,菌泥与乳糖的最佳配比为1∶1,菌体存活率为83.24%。分别以乳糖质量的10%、15%、20%添加全蛋粉、蔗糖、海藻糖以及山梨醇组成复合保护剂,得到乳糖与蔗糖复合保护剂的菌体存活率达到最高为92%。通过对干燥过程中复合保护剂与菌泥比例、温度、真空度优化后得到菌体的存活率进一步提高至95.96%。实验结果表明,复合保护剂对重组运动发酵单胞菌在真空干燥条件下具有很好的保护作用。

乙醇发酵重组大肠杆菌的构建——运动发酵单胞菌pdc基因在大肠杆菌中的高效表达

为了使大肠杆菌代谢葡萄糖和木糖产乙醇,将运动发酵单胞菌乙醇发酵途径中的关键酶基因丙酮酸脱羧酶基因与质粒载体pGM-T连接转化至大肠杆菌TOP10中。丙酮酸脱羧酶基因在T7启动子的启动下得到了高效表达。构建的重组大肠杆菌不但能利用葡萄糖也能利用木糖产乙醇,在葡萄糖和木糖同时存在时,优先利用葡萄糖。

响应面法优化重组运动发酵单胞菌极高密度乙醇发酵工艺

采用基因工程技术,成功地构建了在无需氨基酸和维生素的条件下,能高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖发酵生成乙醇的重组菌Z.mobilis HYMX。为了提高发酵乙醇产量,利用响应面法优化了重组菌极高密度发酵的工艺条件。结果表明,最佳发酵条件为:葡萄糖浓度305 g/L,温度34℃,p H6.5,尿素浓度3 g/L,接种量10%,发酵时间60 h。在此条件下重组单胞菌的乙醇产量达到153.1 g/L,比优化前提高了8.5%,比原型菌产量提高了105.14%。与工业酵母菌株PE-2相比重组菌节省了约12%的葡萄糖,节省了37.5%的时间。

运动发酵单胞菌RecET重组系统的构建及应用

为了提高外源基因整合到染色体的效率,在已构建的运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体基础上,构建了RecET表达质粒pSUZM3a-RecET.选取乙醇脱氢酶Ⅰ(adhA)基因作为靶基因,四环素抗性基因(Tcr)作为筛选标记基因,检测RecET重组系统在Z.mobilis中进行基因重组的可行性.将两端带有60bp adhA基因同源臂的四环素抗性基因片段电击转化含有RecET重组系统表达质粒的运动发酵单胞菌ZM4,获得adhA基因缺失突变菌株.对突变菌株adhA基因的PCR产物进行测序发现,adhA基因已被置换为四环素抗性基因.上述结果表明:RecET重组系统在运动发酵单胞菌中具有高效、便捷和可操作性,只需60bp同源臂即可完成同源重组.

产L-乳酸的运动发酵单胞菌代谢工程菌株的构建

以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)CP4基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆得到其丙酮酸脱氢酶基因(pdc)同源下游p3片段,并连接到广谱宿主载体pBBR1MCS3-Ppdc-ldhL中构建了重组质粒pBBR1MCS3-Ppdc-ldhL-p3,将此重组质粒转化到受体菌Z mobilis CP4中,分别以Ppdc和p3片段作为同源上游和下游片段,利用同源双交换重组技术将重组质粒中的ldhL基因置换了Z.mobilis染色体中的pdc基因,得到重组菌株Z.mobilis CP4(△pdc::ldhL)。测得重组菌株乳酸产量为10.8g/L,明显高于出发菌株,说明初步成功构建了产L-乳酸的运动发酵单胞菌代谢工程菌株。

应用体外重组PCR技术构建Ppdc-ldh融合基因

利用重组PCR技术连接分别从干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC334中扩增的乳酸脱氢酶基因(ldh)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)CP4中扩增的丙酮酸脱羧酶基因启动子(Ppdc)片段,构建了Ppdc-ldh融合基因。并将其克隆到pMD19-T载体上,再转化到大肠杆菌DH5α中,得到阳性克隆质粒pT-Ppdc-ldh。序列分析表明该克隆具有正确的基因序列和阅读框,具有起始密码子GTG和终止密码子TAA,启动子的-35区和-10区序列与起始密码子之间的距离没有改变,可以插入到原核表达载体中进行表达。

一株葡萄糖和木糖共发酵高效产乙醇重组运动发酵单胞菌的性能评价

木糖是木质纤维素原料水解液中的第二大组分,木糖和葡萄糖的充分利用是有经济性地生产纤维素乙醇的关键。通过基因克隆手段构建了一株可以高效利用木糖产乙醇的重组运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis TSH01,并进行了利用单糖溶液、混合糖溶液及玉米秸秆水解液发酵产乙醇效率的研究。结果表明,利用单一葡萄糖或单一木糖溶液发酵时,当糖浓度为8%、发酵72 h后,糖利用率分别为100%和98.9%,乙醇代谢收率分别为87.8%和78.3%;利用8%葡萄糖和8%木糖的混合溶液发酵时,72 h后,葡萄糖和木糖的利用率分别为98.5%和97.4%,乙醇代谢收率为94.9%。利用含3.2%葡萄糖和3.5%木糖的玉米秸秆水解液发酵72 h后,葡萄糖和木糖的利用率分别为100%和92.3%,乙醇代谢收率为91.5%。此外,磷酸二氢钾对发酵过程中木糖利用率以及乙醇收率的提高有明显促进作用。

能利用五碳糖和六碳糖生产乙醇的基因工程菌菌株的构建

燃料乙醇是一种极具前景的燃油代用品 ,近年来发展尤为迅速 ,为了推广这种能源和满足日益增长的需求 ,我们有必要开发更为高效的生产工艺和寻找更为廉价的原料。解决此问题的关键在于获得高效的工程菌 ,使其能利用木质纤维素水解液中的五碳糖和六碳糖发酵生产乙醇。通过代谢工程的研究和基因重组技术 ,几种重组细菌显示出良好的开发前景 ,它们是运动发酵单胞菌、大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌和菊欧文氏菌。

大肠杆菌PTS系统改造及重组菌生长性能测定

利用Red重组系统对野生大肠杆菌Escherichia coli磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(Phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase system,PTS)进行修饰改造,敲除PTS系统中关键组分EⅡCBGlc的编码基因(ptsG),磷酸组氨酸搬运蛋白HPr的编码基因(ptsI),同时敲入来源于运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis的葡萄糖易化体(Glucose facilitator)编码基因(glf),构建重组大肠杆菌,比较测定并系统评价了基因敲除和敲入对细胞的生长、葡萄糖代谢和乙酸积累的影响。敲除基因ptsG和ptsI造成大肠杆菌PTS系统部分功能缺失,细胞生长受到一定限制,敲入glf基因后,重组大肠杆菌能够利用Glf-Glk(葡萄糖易化体-葡萄糖激酶)途径,消耗ATP将葡萄糖进行磷酸化并转运进入细胞。通过该途径转运葡萄糖能够提高葡萄糖利用效率,降低副产物乙酸生成,同时能够使更多的碳代谢流进入后续相关合成途径,预期能够提高相关产物产量。