重组酶介导等温扩增技术(RAA)在病原微生物检测中的应用进展

重组酶介导等温扩增(RAA)是一种恒温快速核酸扩增技术,是重组酶等温扩增技术中具有代表性和前沿性的检测技术,其弥补了现有核酸体外扩增技术需要热循环的局限性,使得核酸体外扩增更加简便快捷,目前已被广泛应用于动物疫病检测。本文介绍了RAA技术的检测原理、引物探针设计及优缺点,综述了其在病毒、细菌、寄生虫及抗生素耐药基因检测等方面的应用进展,总结了国内现有RAA技术标准及检测产品开发情况,以期为拓展RAA技术的应用提供参考。

鉴别鸽新城疫病毒野毒株与疫苗株La Sota的重组酶介导的等温扩增方法的建立

为建立一种能够区分鸽新城疫病毒(NDV)野毒株与常用新城疫疫苗株La Sota的重组酶介导的等温扩增方法(RAA),本研究针对基因Ⅵ型鸽源NDV和La Sota的NP基因设计出1对特异性引物,经过优化引物浓度、反应时间、反应温度,建立了能够区分鸽NDV野毒株与La Sota的RAA检测技术。对其特异性、敏感性和重复性进行测试,并应用建立的方法检测了45份临床样品。结果显示:该技术在15℃~39℃的恒温条件下,可于15 min内完成对目标基因的扩增;对禽支原体、大肠杆菌、沙门氏菌、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒和衣原体等常见病原的检测结果均为阴性;重组质粒标准品检测下限为39.5 copies/反应;45份临床病死鸽样品的检测,检出28份阳性,与常规PCR方法的检测结果一致。本研究结果说明建立的RAA方法可应用于临床样品的快速检测。

基于重组酶介导等温扩增-CRISPR/Cas12a的青鱼物种快速鉴定研究

目的 建立一种快速、特异、灵敏地鉴定青鱼物种的方法。方法 以青鱼线粒体16SrRNA基因的保守序列设计特异性crRNA,并根据crRNA设计重组酶介导等温扩增(recombinase-mediatedisothermal amplification,RAA)引物;建立青鱼的RAA-CRISPR/Cas12a快速鉴定方法,并对该方法的检测时间进行优化;同时,评估该方法的特异性和灵敏度,并对青鱼及其近缘物种的市售样品进行检测。结果 该方法仅需25 min完成检测;对青鱼物种的鉴定表现出显著的特异性,并对其近缘物种如草鱼、赤眼鳟、鳡鱼、倒刺鲃的检测结果均呈阴性;方法灵敏度为1.0×10-3ng/μL(以基因组DNA计);与DNA条形码技术相比,该方法在市售样品的检测结果上表现一致。结论 建立了青鱼物种的RAA-CRISPR/Cas12a现场快速检测方法,该方法具备快速、特异、灵敏的特点,为水产市场或野外环境中快速检测青鱼物种提供了技术手段。

猪伪狂犬病毒荧光重组酶介导核酸扩增快速检测方法的建立与应用

【目的】基于荧光重组酶介导核酸扩增(Recombinase-aided amplification,RAA)技术,建立一种猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)快速检测方法。【方法】根据PRV gE基因序列,设计特异性引物及探针,优化扩增体系,建立PRV荧光重组酶介导核酸扩增检测方法,检验其特异性、敏感性和重复性,应用该方法对临床样品进行检测。【结果】该方法在43℃恒温反应23 min即可完成PRV核酸扩增,最低检出限为111 copies·μL^(-1);与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrheavirus,PEDV)、猪轮状病毒(Porcinerotavirus,PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)均无交叉反应。重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于5%;40份临床样品检测结果显示PRV阳性率为15%(6/40),检测结果与常规聚合酶链式反应(PCR)一致。【结论】成功建立了简便快速、高效准确的PRV实时荧光RAA检测方法,为PRV的快速检测和流行病学调查提供了新的检测手段。

重组酶介导的等温扩增结合CRISPR/Cas12a检测志贺氏菌和克罗诺杆菌

目的应用重组酶介导的等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)结合成簇规则的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),建立志贺氏菌和克罗诺杆菌的快速检测方法。方法通过筛选志贺氏菌和克罗诺杆菌特异性基因,设计特异扩增引物、CRISPR脱氧核糖核酸(CRISPR deoxyribonucleic acid,crDNA)和探针,将靶标进行RAA扩增后,建立CRISPR检测方法。对方法的灵敏度、特异性和应用性进行评价,并与国标检测方法进行对比。结果本研究对志贺氏菌和克罗诺杆菌纯菌液DNA最低检出限分别为4.9×10^(3) CFU/mL、4.4×10^(4) CFU/mL,基因组DNA最低检出限为6.8×10^(‒3) ng/μL、5.7×10^(‒3 )ng/μL,特异性好,与其他病原菌无交叉反应。同时,该方法成功检测出加标猪肉样品和人工污染奶粉中的志贺氏菌和克罗诺杆菌,比国家标准检出限更低。结论本研究建立的RAA-CRISPR方法可有效应用于志贺氏菌和克罗诺杆菌的检测,这为快速筛查食品中是否污染这两种病原菌提供重要价值。

基于重组酶介导等温扩增技术的羊口疮病毒核酸检测方法的建立及初步应用

为建立羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)核酸的快速检测方法,本研究根据ORFV B2L基因保守序列设计特异性引物,通过优化反应温度与时间初步建立了基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的ORFV检测方法。优化试验结果显示:该方法在37℃反应40 min检测效果最佳。采用该方法对ORFV、山羊痘病毒、O型和A型口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、山羊副流感病毒3型等临床常见症状相似的病毒核酸检测,结果显示:该方法除对ORFV的检测结果为阳性外,对羊的其他病毒的检测结果均为阴性,特异性较强。将质粒标准品10倍倍比稀释(1×10^(9)拷贝/μL~1×10^(0)拷贝/μL)后为模板,利用本研究建立的RAA方法检测,结果显示:该方法对ORFV质粒标准品的最低检测限为1×10^(4)拷贝/μL,敏感性较高。利用本研究建立的方法对95份临床样品(15份组织样品和80份血液样品)检测,结果显示:该RAA方法能够对临床样品快速检测,组织样品和血液样品的阳性率分别为33.33%(5/15)和6.25%(5/80),该检测结果与普通PCR检测方法的符合率均为100%,表明本实验建立的RAA方法能够满足临床样品的检测需求。本研究建立的ORFV RAA方法具有操作简单、特异性强、反应快速等特点,为ORFV的快速检测提供新的技术选择。

双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

人偏肺病毒的逆转录重组酶介导等温扩增荧光检测方法的建立

目的建立一种基于逆转录重组酶介导的等温扩增(reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA)方法的人偏肺病毒快速分子诊断技术,并对其检测效果进行初步分析。方法从NCBI数据库中下载人偏病毒基因组序列,利用Mega软件比对分析基因组序列,确定高度保守序列作为分子检测靶标。以人偏肺病毒N蛋白基因保守序列作为靶序列,设计引物和荧光探针。并以宁波地区人偏肺病毒基因组RNA为模板,利用实时荧光定量PCR对荧光RT-RAA检测体系进行评价。以构建含有N蛋白基因序列的不同浓度重组质粒为模板进行RT-RAA荧光扩增,分析其检测灵敏性;利用建立的RT-RAA荧光法分析检测人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和博卡病毒基因组,评价其检测特异性。结果成功建立了人偏肺病毒RT-RAA扩增荧光检测方法,可在30 min内完成偏肺病毒的特异性扩增检测。以重组质粒为检测模板,RT-RAA荧光检测法的最低检出限为102拷贝/μL重组质粒,且均在15 min内出现阳性特异性扩增。与实时荧光定量PCR检测一致性达98.6%,且与其他3种病毒无交叉反应特性。结论成功建立了一种基于RT-RAA扩增的人偏肺病毒荧光检测方法,该方法灵敏度高、特异性好,在人偏病毒快速现场检测中具有潜在应用价值。

基于重组酶介导等温扩增技术的鸡滑液囊支原体检测方法建立和初步应用

为建立一种鸡滑液囊支原体(MS)快速简便的检测方法,研究根据MS vlhA基因保守序列设计3对引物,通过引物筛选和条件优化,建立了基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的MS检测方法,并对其特异性和灵敏度进行评估。应用该方法对68份鸡咽喉拭子临床样品进行检测,并和农业行业标准中的PCR方法进行对比。结果显示:该方法最佳引物为vlhA F3/vlhA R3,在38℃孵育25 min即可完成靶基因扩增,并且特异性强,与鸡毒支原体(MG)、禽多杀性巴氏杆菌、鸡沙门菌、鸡大肠杆菌、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒(AIBV)、鸡传染性法氏囊病病毒等其他鸡病病原体无交叉反应;灵敏度高,对MS基因组DNA的最低检出限度为15.5 pg;应用该方法从68份临床样品中检出阳性样品29份,与PCR方法检测结果一致。研究表明,建立的RAA方法快速简便,不依赖昂贵的仪器设备,有望用于基层实验室或MS的临床快速诊断。

重组酶介导等温扩增技术检测鰤鱼诺卡氏菌方法的建立

为建立一种基于重组酶介导等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)的快速检测鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)的方法,针对鰤鱼诺卡氏菌的特异性基因组片段,设计重组酶介导扩增引物,通过检测7株鰤鱼诺卡氏菌近缘菌和9种水产养殖过程中常见病原菌,筛选出特异性RAA检测引物,并通过将含有目的片段的重组质粒进行梯度稀释以分析该检测方法的灵敏度,最后采用RAA方法检测患病鱼、健康鱼及11种不同来源的鰤鱼诺卡氏菌菌株,以评价该检测方法的应用性和覆盖度。结果表明:本研究中设计的引物仅针对鰤鱼诺卡氏菌可以扩增出目的条带,检测灵敏度为100 pg/μL,人工感染鰤鱼诺卡氏菌的杂交鳢(Channa maculate♀×C.argus♂)肝脏、体肾和脾脏等组织基因组DNA能够扩增出阳性条带,不同来源的鰤鱼诺卡氏菌菌株可以扩增出阳性条带。研究表明,本研究中所建立的鰤鱼诺卡氏菌重组酶介导等温检测方法具有准确、简便的特点,可对鰤鱼诺卡氏菌进行快速检测。

肉制品中鸡源性成分重组酶介导等温扩增检测方法的建立及应用

为了快速准确检测出肉制品中的鸡源性成分,本研究基于鸡线粒体细胞色素B基因(CytB),设计特异性引物和exo探针,建立了实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)方法,进行特异性、灵敏性和稳定性分析,并通过检测市售肉制品对所建立RAA方法的准确性和适用性进行分析。结果表明,该方法可以快速实现对高山鸡肉、乌鸡肉、芦花鸡肉、白羽鸡肉和野鸡肉基因组DNA的特异性扩增,而对猪肉、牛肉、羊肉等的DNA均没有扩增,可稳定检出的鸡源性成分最低质量分数为0.1%。在9份标识有鸡肉成分的市售样品中,7份检出鸡源性成分,有2份样品的鸡源性成分检测结果为阴性。本研究建立的实时荧光RAA方法操作简单,反应迅速,特异性强,灵敏度高,为肉制品中鸡源性成分的检测提供了技术保障。

人乳头瘤病毒6型和11型通用型含内源性内参的重组酶介导的等温扩增技术检测方法的建立

目的建立一种通用型含内源性内参的重组酶介导的等温扩增技术(EIC-RAA)检测人乳头瘤病毒6型(HPV-6)和11型(HPV-11)的方法,以实现HPV-6和HPV-11的简单、准确、快速筛查。方法针对HPV-6和HPV-11的L1片段保守区域设计通用型引物和探针并结合核糖核酸酶P(RNaseP)基因引物和探针作为内参建立了检测HPV-6和HPV-11的EIC-RAA方法;用系列浓度稀释的质粒和不同亚型HPV样本核酸检验其灵敏度、重复性和特异度;收集的230份临床样本进行EIC-RAA和商业化HPV PCR-荧光探针法检测,并对结果进行比较。结果建立的EIC-RAA方法可在39℃条件下30min内实现HPV-6和HPV-11的检测,其灵敏度为10copies/reaction,重复性好,特异度高,EIC-RAA检测结果与商业化HPV PCR-荧光探针法检测结果的符合率为100%。结论建立了一种检测HPV-6和HPV-11的EIC-RAA方法,该检测方法具有简单、准确、快速的优点,在HPV-6和HPV-11的筛查中具有潜在的应用价值。

结核分枝杆菌实时荧光重组酶介导的等温扩增检测方法的建立与应用

目的由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的结核病(tuberculosis,TB)是全球第二大单一感染致死病因,快速和准确的结核诊断技术有助于对其进行精准防控。方法针对MTB菌株插入序列IS6110高度保守区域设计引物和exo探针并进行筛选,建立了MTB实时(real-time,RT)荧光重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法。通过检测11种非结核分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌评价RT-RAA方法的特异性。以实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,q PCR)方法作为平行对照,应用RT-RAA方法扩增梯度稀释的含有目的基因序列不同拷贝数的重组质粒p EASY-Blunt-IS6110,以评价RT-RAA方法的检测敏感度和重复性。将建立的MTB RT-RAA方法应用于173份肺结核临床样品检测中,同时与q PCR方法进行比较。结果建立的MTB RT-RAA方法在42℃条件下30min内即可完成反应;与非结核分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌均无交叉反应;最低检测模板质粒浓度为116拷贝/2μl,优于q PCR方法(138拷贝/2μl);组内和组间的变异系数均小于8%,重复性好。对于肺结核临床样品的检测,RT-RAA方法检测的阳性率与q PCR方法差异无统计学意义。结论本研究建立的MTB RT-RAA方法是一种方便、灵敏和低成本的MTB快速检测方法,具有良好的应用前景。

多黏菌素耐药基因mcr-1重组酶介导扩增方法的建立及应用

根据多黏菌素耐药基因mcr-1的保守序列,设计合成一对重组酶介导扩增方法(RAA)特异性引物和一条FAM标记的荧光探针,优化扩增条件,建立了检测多黏菌素耐药基因mcr-1的RAA方法,验证其特异性和敏感性,并应用于临床检测。结果显示,建立的RAA方法只需21 min就能出结果,能特异性地检测多黏菌素耐药基因mcr-1,最低能检测出10~2的mcr-1阳性质粒拷贝数,也可很好地检测出临床样品中的mcr-1基因。4株临床分离大肠埃希氏菌株样品,有2株mcr-1基因阳性,2株为mcr-1基因阴性。

玉米细菌性枯萎病菌荧光重组酶介导等温扩增检测方法的建立与应用

【目的】建立一种快速、灵敏、特异的玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewarii)重组酶介导等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法。【方法】以玉米细菌性枯萎病菌pstS-glmS基因序列作为靶标序列,设计、合成荧光RAA检测引物和探针,并进行灵敏性测定、特异性验证;使用建立的荧光RAA检测方法检测玉米模拟样本和玉米真实样本,参照标准SN/T 1375-2004方法同步复核,评估荧光RAA检测方法的可靠性。【结果】成功建立了玉米细菌性枯萎病菌荧光RAA检测方法。该方法反应快速,在39℃条件下20 min内即可完成检测反应,特异性好,且灵敏度为280 fg/μL;利用该方法检测6份模拟样本结果阳性,24份真实样本结果呈阴性,与参照标准SN/T 1375-2004检测结果一致。【结论】成功建立了玉米细菌性枯萎病菌快速、灵敏和特异的荧光RAA检测方法,可用于玉米细菌性枯萎病菌的现场检测。

重组酶介导的等温扩增法检测H7N9禽流感病毒

目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成功建立了H7N9禽流感病毒RT-RAA检测方法,H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10copy/μL和100copy/μL,且与其他呼吸道病原无交叉反应。H7N9RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高,Kappa检验u系数为0.933。结论建立的RT-RAA检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为H7N9禽流感病毒的快速检测提供了新的分子工具。

反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)快速检测基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速检测方法,根据其ORF6基因保守序列设计了3对特异性引物,通过引物筛选及条件优化,建立了基因2型PRRSV的反转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA)快速检测方法。结果显示:该方法在40℃恒温孵育25 min即可完成靶序列扩增;特异性强,和猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒均无交叉反应;灵敏度高,最低检出限为2×10^(0)TCID_(50)/μL,是常规RT-PCR方法的10倍;应用该方法对39份疑似PRRSV感染的临床样品进行检测,检出阳性样品25份,和实验室前期建立的荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。以上结果说明,本研究建立的RT-RAA检测方法简便快速、特异性强、灵敏度高、临床适用性好,为PRRSV感染的快速诊断提供了新的技术手段。

玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测方法的建立

玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis)是进境玉米重要检疫性病原物之一。通过分析比较玉米内州萎蔫病菌的纤维素酶基因cel B,筛选出独特和保守的基因序列用于设计引物和探针,利用重组酶介导等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)建立玉米内州萎蔫病菌的荧光RAA检测方法。以cel B基因序列作为靶标序列设计出引物2F、6R和探针P,建立了玉米内州萎蔫病菌荧光RAA检测方法,该方法在39℃恒温条件下,20 min内可完成检测反应,特异性好,且灵敏度高达130 fg·μL^(-1),利用该方法检测4份玉米模拟样本阳性,8份玉米真实样品阴性,检测结果与参照国家标准GB/T 36840—2018一致。结果表明,建立的荧光RAA检测方法快速、特异、灵敏,能够满足现场检测要求。

基于重组酶介导等温扩增技术建立人腺病毒14型快速检测方法及初步应用评价

目的 基于重组酶介导的等温扩增技术(recombinase-aided amplification, RAA)开发一种快速、准确的人腺病毒14型检测方法。方法 根据人腺病素14型(human adenovirus serotype 14, HAdV-14)的Hexon基因序列,使用Primer 6.0软件设计特异性引物及探针,并构建阳性质粒标准品,优化反应条件,建立一种快速RAA检测方法,并对该方法的灵敏度及特异度进行评价。收集2017~2022年中国人民解放军联勤保障部队第九〇三医院发热性呼吸综合征患者的咽拭子50份,应用建立的实时荧光RAA测定法进行检测,结果与实时荧光PCR检测结果进行比较。结果 最终确定了最佳引物探针组合为HAdV14-F1-4,HAdV14-R1和HAdV14-P;经反应条件优化,40℃进行RAA扩增效果最佳;该方法灵敏度为10~1 copies/μl,当质粒标准品浓度为10^(4),10^(3),10^(2)和10^(1) copies/μl时,批内变异系数均<5%;50例临床样本中HAdV-14的检测结果与实时荧光PCR一致。结论 建立了一种基于RAA技术的HAdV-14快速检测方法,可以在仅有简单恒温设备的条件下检测HAdV-14。

基于荧光探针重组酶介导等温扩增技术快速检测食源性单增李斯特菌方法的建立

目的:建立一种基于荧光探针重组酶介导等温核酸扩增(Recombinant Enzyme Mediated Isothermal Nucleic Acid Amplification,RAA)技术的快速检测食源性单增李斯特菌的方法。方法:针对单增李斯特菌hlyA基因的保守序列设计特异性引物和探针,通过构建含hlyA靶基因片段的重组质粒和不同浓度单增李斯特菌核酸,评价其灵敏度;通过检测大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等菌液核酸,评价其特异性。结果:所建立的荧光RAA法可在39℃、20 min内完成样本核酸的检测。采用所建立的方法对质粒和核酸进行检测,质粒最低检出限为1 copy/μL,菌液核酸最低检测限为103 CFU·mL^(-1),且与其他菌株核酸无交叉反应。结论:成功建立了一种基于荧光RAA法的单增李斯特菌核酸检测方法,该方法具有特异性强和快速的特点,可用于疑似污染单增李斯特菌食品的快速检测。