叶片衰老诱导FLP重组酶删除转基因烟草外源基因的研究

【目的】"Gene-deletor"系统可实现转基因植物中外源基因的清除。为了研究该系统在转基因烟草中对清除外源基因的作用并最终创制不含外源基因的烟草新种质。【方法】以含有"Gene-deletor"系统的转基因烟株为材料,分析外源筛合报告选融基因Bar::GUS、重组酶基因FLP在不同叶龄叶片中的表达水平,同时通过观察转基因烟草花粉中GUS蛋白的表达活性,分析外源基因GUS在花粉中的删除情况。【结果】(1)相同叶龄不同转基因烟株叶片均表现出GUS活性和对除草剂草铵膦抗性,且3个转基因烟草株系中GUS活性和对除草剂抗性都表现出随着叶龄增大而降低的特点。(2)Real-time PCR和RT-PCR结果进一步证明外源Bar::GUS基因表达水平随叶片发育成熟持续下降,而外源FLP基因的表达水平则出现先增后降的变化趋势,在测定后期两者的表达量均达到最低,(3)花粉GUS组织染色结果表明,"明,色结果降的变化趋势,特系统诱导各转基因植株中花粉外源基因清除效率不同,平均清除率分别78.3%,54.7%和75.2%。【结论】在转基因烟草中,叶片衰老特异表达基因SAG12基因启动子驱动"动启动子驱动达基因,平均清系统(LoxP/FRT)的表达不仅可引起转基因植株叶片中外源基因的特异性清除,还能诱导花粉中外源基因的删除,该技术可为进一步创制培育不含外源基因的烟草新种质提供参考。

基因重组抗原酶联免疫法检测兔出血症病毒抗体及其标准化

以重组兔出血症病毒 (RHDV) VP6 0蛋白为抗原 ,建立了 RHDV抗体间接 EL ISA检测方法。优化的试验反应条件为 :重组 VP6 0的包被质量浓度为 1.0 mg/ L ,用 10 %牛血清封闭 ,以大肠杆菌提取物稀释被检血清以消除非特异性反应。将所建立的 EL ISA与现行血凝抑制 (HI)试验比较发现 ,不同免疫状态的兔血清的 RHDV EL ISA抗体与 HI抗体均呈正相关。对 11个 RHD免疫兔场 1130份血清样品的抗体检测表明 ,各免疫兔群血清 RHDV抗体水平不完全一致 ,D值在 1.0 9～ 1.76之间 ,显著高于非免疫兔 (0 .0 5 )及 SPF兔 (0 .0 2 ) ,低于高免兔 (2 .34)。在此基础上 ,研制了RHDV抗体酶联免疫检测试剂盒 ,测定了其主要指标 ,制定了各成分的质量控制标准 。

重组一氧化氮合酶基因在心血管系统的转染和表达

一氧化氮 (NO)功能异常在许多心血管系统疾病的发病中起重要作用 ,用转基因方法转移重组一氧化氮合酶(NOS)基因 ,重建内源性 NO功能 ,是心血管系统治疗的新策略 ,本文就重组 NOS转基因在心血管系统的研究进展作一综述。

原核基因工程制备新型重组α-半乳糖苷酶应用于人B→O血型改造的研究

本研究利用基因工程方法制备脆弱类杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶并将其应用于人B→O血型改造。在获得了能够表达细菌α-半乳糖苷酶工程菌株的基础上,从诱导时间、诱导剂浓度两个方面对工程菌株的诱导条件进行优化,获得细菌α-半乳糖苷酶的最佳可溶性表达条件;超声上清经过阳离子交换层析和阴离子交换层析等方法进行纯化。利用纯化后的α-半乳糖苷酶在磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中处理B型红细胞2小时,制备O型红细胞。结果表明细菌α-半乳糖苷酶最佳诱导表达条件为:37℃、起始D600为0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为2小时。纯化后α-半乳糖苷酶的纯度为电泳纯,比活由纯化前的0.42 U/mg提高到了2.1 U/mg。该酶在26℃、接近中性的pH条件(6.8)下经2小时可将B型红细胞改造成O型红细胞,需要的酶量为225μg/ml红细胞。结论:建立了重组细菌α-半乳糖苷酶的表达纯化工艺,制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,为B→O血型改造提供了更有效的工具酶。

类产碱假单胞菌酪氨酸酶基因重组子所产黑色素性质的研究

将构建的含有嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因的重组质粒导入从自然病死蝇蛆体内分离的具有显著杀蛆作用的类产碱假单胞菌体内 ,使后者获得了稳定产生黑色素的能力 ,具有很强的抗辐射作用。所产黑色素是无定形物质 ,在大多数有机和无机溶剂中溶解度低或不溶解 ,在碱性溶液中有较好的溶解性 ,在中性及弱酸性溶液中溶解度低 ,在pH <4的溶液中沉淀 ;可用过氧化氢或次氯酸钠氧化 ,也能被银离子或硫化氢还原 ;含有自由基 ,并能清除由紫外线诱导产生的自由基 ;能吸收所有波长的光线 ,在紫外波长下吸收值最大 ,能有效地保护紫外辐射对蛋白质及DNA等生物大分子物质的损害。

重组人组织激肽释放酶基因转染人脐静脉内皮细胞

目的 探讨重组人组织型激肽释放酶 (HK)基因腺相关病毒载体 (rAVV/HK)对体外培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)作用。方法 将HK基因定向克隆入腺相关病毒质粒 pAAV MCS中 ,形成重组腺相关病毒 (rAAV HK)质粒 ,经聚合酶链反应 (PCR)检测和DNA测序后 ,将rAAV HK、pAAV Helper和 pAAV RC 3种质粒通过脂质体共转染 2 93细胞 ,包装成带有HK目的基因的重组rAVV/HK ,采用 β半乳糖苷酶原位染色法测定报告基因rAVV/LacZ在HT10 80中的表达 ,间接计算病毒滴度 ,并观察转染基因在传代细胞中的表达。在相同的条件下体外分别培养HUVECs(对照组 )和rAVV/HK转染的HUVEC(HK转染组 ) 4 8h ,采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测两组HUVECsHKmRAN的表达 ,并利用硝酸还原酶法和分光光度法分别检测两组HUVECs一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶 (NOS)活性。结果 rAVV/HK病毒滴度为 6 .2× 10 7个 /mL ,LacZ基因能够在第一传代和第六代HT10 80细胞内稳定持续表达。与对照组比 ,HK转染组HUVECsHKmRNA表达增加 (P <0 0 0 1) ;而且HK转染组HUVECs细胞培养液中NO的含量和NOS活性明显增高 ,P值分别 <0 0 1和 <0 0 5。结论 HK基因通过重组腺相关病毒载体可成功转染体外培养的HU VECs ,使其HKmRNA表达增加 。

细菌内同源重组构建和制备含过氧化氢酶基因的重组腺病毒

利用细菌内同源重组法构建制备含过氧化氢酶基因的重组腺病毒。先自过氧化氢酶质粒载体pZeoSV2-Cat中酶切出过氧化氢酶cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,形成转移质粒pShuttle-CMV-Cat,再转化含pAdEasy-1的超感受态大肠杆菌BJ5183,采用细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAdEasy-1-Cat;用PacI酶切线性化pAdEasy-1-Cat,转染Ad-293细胞,包装成重组腺病毒颗粒;用氯化铯超速梯度离心纯化获取高滴度的重组腺病毒AdCat。结果发现,线性化的pShuttle-CMV-Cat转化含pAdEasy-1的超感受态大肠杆茵BJ5183,24 h后获得了30％阳性重组质粒克隆,经酶切鉴定说明pAdEasy-1-Cat构建成功。重组质粒经Ad-293细胞包装后产生的重组腺病毒经聚合酶链反应检测表明含有目的基因。氯化铯纯化获取的重组腺病毒滴度为4.12×1015OPU/L。说明应用细茵内同源重组能快速构建含过氧化氢酶基因的重组腺病毒载体pAdEas-1-Cat,可高效制备均一的高滴度重组腺病毒。

利用重组荧光素酶报告基因载体研究E2F调控组蛋白H2A的转录

转录因子E2F与细胞增殖、凋亡及癌变密切相关,组蛋白H2A是构成核小体的重要成员之一。研究通过特异性的阻断Rb基因的表达发现组蛋白H2A家族成员:HIST1H2AJ表达下调,再进一步研究转录因子E2F对HIST1H2AJ的转录调控。通过PCR得到HIST1H2AJ的5'非翻译区序列,克隆到荧光素酶报告载体pGL3中,然后转染入HEK293,再检测荧光素酶的活性来判断E2F是否调控HIST1H2AJ的转录。研究结果表明:转录因子E2F能够调控组蛋白H2A家族成员之一HIST1H2AJ的转录。

青霉纤维素酶基因的表达调控与重组表达研究进展

青霉属菌株可以分泌完整的纤维素酶系,尤其高产β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BGL,EC 3.2.1.21),弥补了工业菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)胞外β?葡萄糖苷酶活性低的不足,加上青霉菌株生长速度快等优点,使其产纤维素酶受到越来越多的关注。为了解决以木质纤维素为原料工业生产燃料乙醇所需纤维素酶量大、成本高等难题,深入研究青霉属纤维素酶基因的表达调控和重组表达非常重要。本文就青霉属纤维素酶基因资源、纤维素酶合成调控网络以及纤维素酶基因的重组表达等进行综述与展望。

补料培养对基因重组糖多孢红酶菌生长的影响

目的为了建立基因重组糖多孢红酶菌的生长环境平台,对培养基和生长条件进行优化。方法利用发酵罐模拟工业生产过程,采用补料3级培养的方法,对培养基成分进行筛选试验。结果培养温度为30~34℃,p H≤7.1,搅拌转速变换在700~900 r·min^-1;空气流量在0.35~0.85 vvm,最佳生长培养基：糊精30 g·L^-1、黄豆粉32 g·L^-1、ARGO玉米粉32 g·L^-1、玉米浆18 ml·L^-1、纯豆油6 ml·L^-1。结论基因重组糖多孢红酶菌在上述培养基条件下生长168 h可达到高峰。

重组ALA合酶基因(YHem1)转化草莓提高叶片光合能量转化能力的效应

为了培育高光合抗逆草莓新品种,以红颊草莓试管苗叶片为外植体,研究了植物生长调节剂对草莓叶片再生的影响,然后将拟南芥HemA1基因启动子控制的酿酒酵母ALA合酶基因(Hem1)的重组基因(YHem1)通过农杆菌介导法转入草莓离体叶片中。经卡那霉素筛选,PCR和RT-PCR检测,证明外源基因已经转入草莓体内,获得3株转基因植株。叶片快速叶绿素荧光特性测定显示,转基因草莓叶片PSII最大光化学效率(Fv/Fm)、光合性能指数(PIABS)和捕获的激子将电子传递到QA-下游的其他电子受体的概率(ψo)显著高于野生型,而QA被还原的最大速率(Mo)则低于野生型,说明转入YHem1基因提高了草莓叶片光合能量转化能力。

高表达重组人组织激肽释放酶7基因的前列腺癌单克隆细胞株的构建

目的建立稳定高表达重组人组织激肽释放酶7基因(KLK7)的前列腺癌细胞株DU145,为前列腺癌发生机制的研究奠定基础。方法 PCR法扩增KLK7 cDNA,并克隆到真核表达载体pcDNA3.1上;经过限制性内切酶酶切、DNA测序验证正确后,以脂质体法转染人前列腺癌DU145细胞;通过G418筛选,每个单克隆细胞扩大培养,建立稳定转染KLK7的DU145单克隆细胞株。采用Western blot法检测DU145细胞株KLK7表达。结果酶切鉴定及DNA测序分析显示pcDNA3.1-KLK7真核表达载体成功构建;转染后,成功获得稳定高表达KLK7的DU145单克隆细胞株。Western blot结果显示,pcDNA3.1-KLK7转染的DU145细胞KLK7表达量明显高于转染空载体组细胞(P<0.01)。结论 pcDNA3.1-KLK7真核表达载体的建立及稳定高表达KLK7的前列腺癌单克隆细胞株的建立,为研究KLK7在前列腺癌发生发展中的作用提供了条件。

重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建转染及转染细胞萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶表达

目的构建重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron,并观察其在非小细胞肺癌细胞株PC-9转染后对萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶表达。方法以双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2中的嵌合体内含子(设计长度为133 bp)为模板,PCR扩增后插入到psiCHECK-2质粒中,即获得重组双荧光素酶报告基因质粒psi-CHECK-2-Intron。取psiCHECK-2-Intron质粒,转染至感受态大肠杆菌中,采用琼脂糖凝胶电泳实验观察目的基因片段长度,并对目的基因片段进行基因测序。将重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron、双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2分别转染至PC-9细胞中,记为转染组、对照组,采用qRT-PCR法检测两组细胞中萤火虫荧光素酶mRNA、海肾荧光素酶mRNA,采用双荧光素酶活性实验检测两组细胞中萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性。结果目的基因片段长度为133 bp,基因序列正确,无突变和缺失,表明重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建成功。转染组细胞中萤火虫荧光素酶mRNA、海肾荧光素酶mRNA的相对表达量分别为2.213±0.038、2.004±0.025,对照组分别为1.004±0.012、1.003±0.010,两组相比,P均<0.05。转染组细胞中萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性分别为2.974±0.099、1.948±0.052,对照组分别为1.000±0.018、1.000±0.020,两组相比,P均<0.05。结论成功构建了重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron;psiCHECK-2-Intron转染PC-9细胞后,细胞中萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶的表达均升高。

重组α-半乳糖苷酶酶解大豆低聚糖研究

本研究应用本实验室基因重组咖啡豆α-半乳糖苷酶对棉籽糖和水苏糖进行了酶解,应用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)法检测了酶解前后大豆低聚糖的变化情况,结合大豆制品传统加工工艺,提出了酶的添加方式和工艺。

重组α-半乳糖苷酶消除大豆低聚糖引起的小鼠肠胃胀气的研究

目的:分析食用大豆及其制品中的低聚糖引起肠胃胀气的原因。基因重组α-半乳糖苷酶对棉籽糖和水苏糖进行酶解,低聚糖对小鼠肠胃胀气的缓解情况。方法:以棉籽糖和水苏糖标准品作为受试物,分别灌胃给予不同周龄的昆明种小鼠,分析棉籽糖和水苏糖是否引起小鼠肠胃胀气;通过测量小鼠胀肠容积的方法检测胀气情况;硅胶薄层层析(TLC)检测低聚糖;SDS-PAGE法检测大豆蛋白。结果:棉籽糖、水苏糖均能够引起小鼠肠胃胀气;基因重组α-半乳糖苷酶可以消除小鼠食用棉籽糖和水苏糖后的肠胃胀气现象,添加的α-半乳糖苷酶对大豆蛋白没有影响。结论:α-半乳糖苷酶可做为食品添加剂,用来解决食用豆制品时发生的肠胃胀气。

ipt基因促进矮牵牛遗传转化效率及热激启动子驱动基因删除

本研究主要探讨ipt基因对矮牵牛遗传转化不定芽诱导影响及拟南芥热激启动子hsp18.2驱动重组酶基因flp的热诱导外源基因删除表达载体在矮牵牛中的基因删除效果。本研究中将植物表达载体pBin-hsp18.2:flp-35S:ipt及对照载体pBin-hsp18.2:flp遗传转化矮牵牛,以获得转基因植株,分析比较不定芽的诱导和转基因植株进行的热激基因删除。研究结果表明,ipt基因可促进矮牵牛遗传转化过程中不定芽的诱导,其不定芽诱导率为21.5%,显著高于对照的8.7%。在44℃,6h,热激6次的条件下,转基因矮牵牛植株表型恢复正常,经GUS蛋白表达分析及PCR、RT-PCR检测,证明外源基因已经被删除。转基因矮牵牛基因删除效率最高可达43.8%。本研究为ipt基因在一些遗传转化困难植物转基因中的应用奠定了基础。

基因重组丝虫融合蛋白抗原抗丝虫的保护性免疫及用于丝虫病血清学诊断、监测的研究

目的:测定基因重组丝虫壳质酶融合蛋白抗原对动物感染丝虫的保护性免疫作用和用于丝虫病血清学诊断和监测的评价。方法:用基因重组壳质酶抗原免疫沙鼠,ELISA方法检测动物及人血清中的抗体水平,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹试验测定特异的蛋白质分子。结果:壳质酶抗原可诱导动物体内产生特异的抗丝虫抗体,在用丝虫感染期幼虫攻击感染后,这种特异的抗体可使沙鼠血循环中微丝蚴(Mf)出现的时期明显推迟,MI数显著减少,成虫数也减少。壳质酶抗原与微丝蚴可溶性抗原(Mf-xt)检测Mf阳性沙鼠、正常沙鼠、Mf血症患者、流行区非Mf血症者和非流行区正常人的血清抗体水平中壳质酶检测的结果分别为100％,0,100％,5％和O,则Mf-xt为80％,0,80％,20％和5％。证明壳质酶抗原较Mf-xt敏感性高,特异性强。结论:壳质酶融合蛋白抗原免疫沙鼠具部分的抗丝虫感染的保护性免疫作用。壳质酶抗原同样可用于丝虫病的血清学诊断和监测。

药物代谢体外模型的研究进展

对药物代谢体外模型进行综述。介绍各模型的研究方法、特点和应用进展,为药物代谢的科学评价提供重要的参考。