重组酶聚合酶侧流层析技术检测新冠病毒核酸快速诊断方法的初步建立

目的建立重组酶聚合酶扩增侧流层析技术(RPA-LFD)检测新冠病毒(SARS-CoV-2)核酸快速诊断方法,为基层医院和边远地区防控新冠病毒疫情提供技术支持。方法根据新冠病毒N基因核苷酸序列中保守序列,通过生物信息学软件分析、设计和筛选最佳的重组酶聚合酶扩增引物及侧流层试纸探针,优化重组酶聚合酶扩增反应条件以及检验建立方法的灵敏性和特异性。结果利用RPA-LFD法在37℃下反应15 min可检测到每个反应最低100 fg含量的新冠病毒,并与流感病毒、副流感病毒、鼻病毒和腺病毒没有交叉反应,因此据此可以建立灵敏性高、特异性强和可操作性强的新冠病毒快速诊断方法。结论通过RPA-LFD技术建立的新冠病毒快速诊断方法可获得较为理想的灵敏度、特异性,为进一步研制新冠病毒核酸快速诊断试剂盒奠定了基础。

重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条快速检测新加坡石斑鱼虹彩病毒

为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的方法,本研究针对SGIV特异基因ORF014L序列设计特异性引物及探针,建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)(RPA-LFD)的SGIV检测技术。RPA反应使用10μmol/L的引物浓度,在40.1℃恒温反应20 min即可完成特异性病毒的检测,最低检测限为102个/μL标准质粒。RPA-LFD反应在42℃恒温反应8 min可将检测结果通过试纸条可视化呈现,最低检测限为101个/μL标准质粒,且不与其他常见水生动物病原发生交叉反应,临床样品检测结果也与PCR检测结果一致。RPA、RPA-LFD均能特异性检测SGIV,两者的检测限均比常规PCR灵敏。RPA-LFD法具有快捷简单、结果可视化的特点,在临床应用具有较好的应用前景。

双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术结合核酸杂交侧流条快速检测牛肉中的鸡、鸭、猪源性成分

目的 建立双拖尾重组聚合酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合核酸杂交侧流条(nucleic acid hybridization-lateral flow strip, NAH-LFS)快速检测牛肉中鸡源、鸭源、猪源性成分的可视化检测技术。方法 采用多重双拖尾RPA技术与NAH-LFS相结合,对鸡、鸭、猪线粒体D环区域设计特异性拖尾RPA引物,扩增出双拖尾的RPA产物。鸡、鸭、猪3个物种RPA产物的拖尾序列分别与红、黄、蓝3种颜色的金纳米探针和侧流条上的检测探针杂交。结果 鸡、鸭、猪3个物种RPA产物与探针杂交后形成肉眼可见的红、黄、蓝3色条带,整个RPA扩增(15 min)和侧流条检测(5 min)过程在20 min内即可完成。该方法对牛肉中鸡、鸭、猪肉的检出限达0.01%,且仅对鸡、鸭、猪肉DNA有特异性,与其他10个物种的DNA均无交叉反应。采集50份市售牛肉样品,使用该方法进行真实性检测:10份牛肉干、10份生牛肉、10份酱牛肉中未检测出其他动物源性成分, 10份牛肉馅料中检测出1份含猪源性成分, 10份牛肉片中检测出1份含鸡源性成分。该方法与聚合酶链式反应结合凝胶电泳的检测结果具有很好的一致性。结论 RPA技术结合NAH-LFS具有特异性强、灵敏度高、操作简单的优点,可实现牛肉中鸡、鸭、猪源性成分的同时可视化快速检测。

塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测方法的建立

为建立塞尼卡谷病毒(SVV)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对SVV 3D基因设计了引物和探针,通过反应条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了SVV RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒无交叉反应;在40℃、20 min内可检测的最低浓度为56拷贝/μL质粒标准品;通过3次重复试验检测,LFD检测线灰度值变异系数范围在4.49%~9.73%。利用该方法对120份国内临床样品进行检测,结果均为阴性。本研究首次建立了检测SVV的等温、快速RPA-LFD方法,读取结果不依赖任何仪器设备,为猪群感染SVV的现场快速诊断、流行病学研究和根除方案的制定提供帮助。

重组酶聚合酶扩增反应结合侧流层析试纸条技术快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪

建立了重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification,RPA)结合侧流层析试纸条技术(RPA-lateral flow dipstick,RPA-LFD)快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪的方法。对比大西洋鳕鱼和常用来冒充鳕鱼的鱼类线粒体基因组序列,设计针对大西洋鳕鱼的特异性探针和引物,建立针对大西洋鳕鱼的RPA-LFD检测方法。该实验筛选最佳引物和探针并评估其特异性,优化反应温度、时间和现场检测条件,并对20份市售“大西洋鳕鱼”及常见的冒充鳕鱼的鱼类制品进行现场检测,评估检测效果。实验结果表明,RPA-LFD检测方法特异性强,在44℃、14 min条件下的检测效果最好。在现场开展快速检测,效果良好,20份鳕鱼制品检测结果经过基因测序证实和产品真实成分一致。该研究建立的大西洋鳕鱼RPA-LFD检测方法特异性强、反应耗时短、操作简便、结果可视,有良好的现场快速检测应用前景,为大西洋鳕鱼制品现场快速检测提供了新思路,为水产品市场监管提供了技术支持。

猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增快速诊断方法的建立和应用

旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶扩增的引物,优化了重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)反应体系,检测了反应的特异性和敏感性,确定了反应的最佳温度和时间,通过结合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的方法进行分析和鉴定。试验结果显示反应的最佳温度和时间为30℃、20 min,反应可以检测到的最低质粒拷贝数为102 copies·μL^(-1),且在对猪的丁型冠状病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和圆环病毒2型的检测中具有良好的特异性。综上所述,通过对RPA反应条件的摸索与优化,成功建立了猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合琼脂糖凝胶电泳(Basic RPA)和侧流层析试纸条(LF-RPA)的检测方法,两种方法相比较于RT-PCR,有更短的检测时间且具有更高的敏感性,对仪器、场地和检测环境的要求更低,为今后PEDV的临床诊断及快速检测提供了更多的选择和更有效的技术支持。

基于重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条快速检测鲤疱疹病毒2型的方法研究

为建立CyHV-2的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析(RPA-LFD)快速检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的方法,针对鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因设计引物和探针,优化反应温度和时间条件,建立了鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法,并将样品简易处理方法运用于该方法对实验室保存的鲫组织样品进行检测。结果显示,该RPA-LFD检测方法最佳反应条件为40℃20 min,最低检出限为6×10^(0) copies/μL,与荧光PCR的灵敏度相当,与其他鲤疱疹病毒等无交叉反应;运用该方法并结合待检样品简易处理方法(直接RPA法)对50份鲫组织样品进行处理和检测,其结果与运用国家标准(GB/T 36194-2018)中荧光PCR方法检测结果一致。本文建立的RPA-LFD检测方法具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、特异性强的优点,适于在水产养殖场和基层部门用于鲤疱疹病毒病的辅助诊断和监测。

杀鲑气单胞菌可视化重组酶聚合酶扩增检测技术的建立

本研究根据杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的铁载受体(fstA)基因的保守序列设计特异性引物和探针,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与侧向流试纸条(lateral flow strips,LFS)相结合的可视化快速检测杀鲑气单胞菌的方法。结果显示:本研究建立的基于RPA-LFS的杀鲑气单胞菌检测方法在37℃孵育25 min即可完成,特异性良好,与其他致病菌无交叉反应;灵敏度实验结果显示,该菌的纯培养物和人工污染的鲤鱼组织中的最低检测限均为单次反应1 CFU(colony forming unit)。本研究建立的基于RPA-LFS的杀鲑气单胞菌检测方法具有特异、灵敏、快速等优点,检测结果可通过肉眼直接观察,操作简单,不依赖昂贵的仪器设备,适用于养殖业中杀鲑气单胞菌的现场检测。

基于重组酶聚合酶扩增结合侧流层析技术的B、E型腺病毒快速可视化检测方法的研究与评价

目的建立一种快速、准确、可视化、易开展的B、E型腺病毒检测技术。方法针对B、E型腺病毒壳蛋白保守序列设计通用引物,建立可同时检测出这两种腺病毒型别的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测技术,评价其灵敏度与特异性,并验证最佳反应温度与反应时间,同时利用该法对19例B、E型腺病毒感染患者及10例健康志愿者鼻咽拭子标本进行检测。结果腺病毒LFD-RPA法检测灵敏度可达10拷贝/μl,与q PCR方法相近,且不会与其他亚属腺病毒及其他病毒发生交叉反应。反应可在25~45℃温度范围内高效进行,检测全程仅需15~20 min。利用临床咽拭子标本对检测体系进行评估,其灵敏度及特异性均达100%。结论该检测方法灵敏度高、特异性强、操作简单,反应快速,能脱离对大型仪器、专业操作人员及正规实验室的依赖,在基层卫生部门,尤其在野外及现场检测中具有极大的应用潜力。

侧流层析–重组酶聚合酶扩增技术快速检测土拉弗朗西斯菌

目的利用侧流层析–重组酶聚合酶扩增(LF-RPA)技术建立快速、敏感、特异的土拉弗朗西斯菌(土拉菌)检测方法。方法基于土拉菌特异性基因(tul4)设计重组聚合酶恒温扩增方法的引物及探针,优化反应时间和温度,同时评价该方法的灵敏度及特异性,并通过模拟血液样品评估此方法的实用性。结果该方法最佳反应条件是40℃,20 min,可检测核酸浓度最低为20fg/μl,与实时荧光定量PCR(qPCR)方法相近,且不与7种非土拉菌发生交叉反应。土拉菌模拟样本最低检测浓度为460CFU/ml。结论该检测方法操作简单,特异性良好,敏感度高且无需大型精密实验设备,在临床及现场检测土拉菌中具有应用前景。

酶促重组酶扩增-侧流层析快速检测沙门菌的方法研究

目的建立一种酶促重组酶扩增(ERA)和侧流层析技术(LF)相结合的沙门菌快速检测方法,为沙门菌现场检测提供技术支持。方法根据沙门菌属高度保守的鞭毛基因fimY设计特异性ERA引物,采用毛细管电泳筛选合适的引物,再设计探针,对扩增温度和时间进行优化,建立ERA-LF检测体系对菌株DNA进行扩增,采用侧向流试纸条检测产物。采用鼠伤寒沙门菌标准菌株检验方法的灵敏度,采用10种其他肠道感染标准菌株检验特异度,采用实际分离到的沙门菌验证对实际样本检测能力。结果经过毛细管电泳筛选获得沙门菌特异性引物,在扩增温度为37℃、反应时间为20 min的条件下,最低检测浓度为5 copies/μL。本方法对沙门菌核酸扩增结果为阳性,10株其他肠道感染菌核酸扩增结果均为阴性,特异度较好。对100株(包含10种血清型)沙门菌进行检测,结果均显示阳性。结论本研究建立的ERA-LF方法可用于沙门菌的现场即时检测。

芋疫霉重组聚合酶扩增结合侧流层析试纸条快速检测方法的建立及应用

为建立芋疫霉Phytophthora colocasiae快速准确的分子检测方法,基于Ypt1基因特异序列,设计芋疫霉的特异性引物与探针,建立一种快速、准确、可视化的芋疫霉重组聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测方法,对该检测方法进行优化,评估其特异性与灵敏度,并对田间疑似样品进行检测。结果表明,优化后的芋疫霉LFD-RPA检测方法最适反应条件为39℃恒温反应30 min。LFD-RPA检测方法能够特异性地检测出芋疫霉,而对其他卵菌近缘种和常见植物病原真菌均未检出,且该检测方法对芋疫霉DNA的检测灵敏度达到1 pg/μL。对田间带病组织检测发现,LFD-RPA检测方法能够快速准确地从田间自然发病植株中检测出芋疫霉。表明本研究所建立的芋疫霉LFD-RPA快速可视化检测方法特异性好、灵敏度高、简单快捷,可用于芋疫病的田间快速诊断。

基于EuNPs的荧光侧流免疫层析联合双重RPA检测HPV16和HPV18的价值

目的探讨重组酶聚合酶扩增(RPA)联合铕纳米粒子标记的荧光侧流免疫层析试纸条(EuNPs-LFIC)检测HPV16和HPV18的价值.方法根据HPV16和HPV18基因保守区域(L1),采用Primer5软件设计特异性引物和探针.采用荧光读数仪扫描EuNPs试纸条,对RPA扩增产物定量分析.评估EuNPs-LFIC-RPA方法的敏感度和特异性,并与qPCR检测结果对比,计算实际临床样本检出符合率.结果在37℃等温条件下,RPA反应可在10min内完成.通过读取试纸条的荧光信号强度获得定量结果.EuNPs-LFIC-RPA方法可进行病毒单拷贝基因检测,并未观察到与HPV其他亚型的交叉反应.检测临床样本248份,与PCR-反向点杂交法的一致性分别为98.38%(κ=0.92,HPV16)、97.58%(κ=0.88,HPV18)和98.79%(κ=0.96,HPV16/18),EuNPs-LFIC-RPA同时检测HPV16和HPV18的敏感度和特异性分别是94.12%和100.00%.结论建立EuNPs-LFIC-RPA方法可满足宫颈细胞样本快速筛查的要求,为高危型HPV病毒临床检测提供新方法.

牛病毒性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)快速诊断方法的建立与应用

本研究开发了一种基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术结合侧流层析试纸条(LFD)快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法。该方法根据5′-UTR保守序列设计nfo RPA特异性引物和探针,35℃孵育25 min即可完成对BVDV核酸的识别与扩增,室温条件下仅需5 min便可肉眼在试纸条上观察到结果。结果显示,该方法最低检测限为60 copies/μL,且仅能够检测出BVDV1型和2型,与猪瘟病毒(CSFV)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)等其他病毒无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。对临床样本的检测结果表明,该方法的测定性能与RT-qPCR一致,且RPA-LFD操作更加快速便捷,更适合现场环境中使用。

猪嵴病毒重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)快速诊断方法的建立与应用

自2007年在猪粪便中首次检测到猪嵴病毒(PKV)以来,该病毒已在世界范围内被广泛报道,并可能与仔猪的腹泻有关。本研究首次建立了以重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)的技术来检测PKV的快速、可视化的诊断方法,并对此方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果显示,该方法具有良好的特异性,仅可以特异性扩增PKV,与其它主要猪病毒没有交叉反应;最佳反应时间和温度是RPA在37℃下20 min及LFD在室温下10 min;检测极限为1×10~2拷贝的PKV。利用本研究建立的RPA-LFD方法和常规RT-PCR方法同时检测20份猪的临床粪便样品,结果显示,RPA-LFD方法检测猪嵴病毒阳性率为60%,明显高于常规RT-PCR的50%。上述结果表明,RPA-LFD方法可应用于猪嵴病毒的快速检测。

李矮缩病毒重组酶聚合酶扩增—侧流层析试纸条检测方法的建立

根据李矮缩病毒(prunedwarfvirus,PDV)外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针,建立了PDV的重组酶聚合酶扩增—侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification combined with lateral flow dipstick,RPA-LFD)检测方法。该方法在恒温39℃下反应20 min,具有标记的扩增子可达到检测水平。扩增子检测室(amplicon detection champer)中的侧流层析试纸条在20 min内呈现可视化检测结果。该方法与侵染樱桃的另外6种病毒(CGRMV、PNRSV、Lch V-1、PBNSPa V、CVA和CNRMV)无交叉反应。灵敏度试验表明,用RPA-LFD方法检测PDV的灵敏性是PCR方法的10倍。用该方法检测13个田间样品,其检测结果与PCR检测结果一致。RPA-LFD法具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强等特点,适合对PDV样品的快速检测与鉴定。

基于重组酶聚合酶扩增结合侧向流试纸条快速检测H7亚型禽流感病毒的方法研究

目的建立一种快速、灵敏、可视化的H7亚型禽流感病毒等温核酸扩增检测方法。方法针对H7N9禽流感病毒的HA片段保守区序列设计引物、探针,优化反应温度,建立H7亚型禽流感病毒的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条检测技术,评价其特异性和敏感性,并与Real time PCR方法进行比较。结果该方法检测H7亚型禽流感病毒的最低检出限为20拷贝/μL,与其他流感/禽流感病毒无交叉反应,反应可在20~50℃温度范围内进行,临床样本检测结果与Real time PCR法一致性为100.0%。结论该检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为在基层和现场快速检测H7亚型禽流感病毒提供了新的方法。

空肠弯曲菌的侧向流RPA快速检测方法研究

目的:建立一种可现场快速检测空肠弯曲杆菌的方法。方法:应用重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术,设计引物探针,建立侧向流RPA法,使用特异性、灵敏性实验对该方法进行验证。结果:实验所用的所有非空肠弯曲菌在侧向流试剂盒上都是阴性的,空肠弯曲菌都是阳性的;该方法的检出限为1.2×10^3 CFU/mL。结论:本研究制作的RPA技术制作的侧向流试剂盒特异性和灵敏性良好,简单快捷,具有较强的应用价值。

甘薯褪绿矮化病毒西非株系RT-RPA-LFD检测方法的建立与应用

【目的】利用逆转录酶重组酶聚合酶扩增(reverse transcriptase recombinase polymerase amplification,RT-RPA)结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条技术,建立甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)西非株系(west African strain,WA)的RT-RPA-LFD检测方法。【方法】根据SPCSV-WA外壳蛋白基因和热激蛋白基因的保守序列设计并筛选扩增效果好、特异性强的引物和探针。然后对引物和探针的浓度、扩增体系、温度、反应时间等条件进行优化,建立SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法。利用该方法对SPCSV-EA、甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)、甘薯潜隐病毒(sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(sweet potato virus G,SPVG)等常见的甘薯病毒进行检测,验证方法的特异性;将感染SPCSV-WA甘薯叶片样品总RNA进行10倍梯度稀释,分别采用RT-PCR和RT-RPA-LFD进行检测,比较RT-PCR和RT-RPA-LFD方法的灵敏度;对采自田间的甘薯样品和试管苗样品进行RT-RPA、RT-RPA-LFD和RT-PCR检测,验证该方法的实用性。【结果】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,最适引物为CSV357F/R,探针CSV-CP-Probe(47 bp),引物和探针工作浓度分别为0.2和0.06μmol·L-1,温度为42℃,时间5 min。该方法可对SPCSV-WA进行特异性检测,与甘薯上其他常见病毒无交叉反应。RT-RPA-LFD最低可检测到总RNA稀释至10-4溶液,而RT-PCR最低检测到总RNA稀释至10-3溶液,RT-RPA-LFD灵敏度是RT-PCR的10倍。田间采集的22份甘薯样品经RT-PCR、RT-RPA和RT-RPA-LFD检测,均检出11份阳性样品,3种方法检测结果一致。28份试管苗样品的检测结果表明,RT-PCR和RT-RPA-LFD检测结果一致,均检出5份阳性样品。【结论】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,该方法具有快速、简便、特异、灵敏、可视的特点,既可用于甘薯脱毒试管苗样品的病毒检测,也适用于基层单位田间甘薯病毒样品的现场快速检测。

基于重组酶聚合酶扩增技术快速检测霍乱弧菌中SXT元件

目的利用重组酶聚合酶扩增技术与测流层析相结合方法建立霍乱弧菌中SXT元件的快速检测方法。方法基于SXT元件的保守区设计重组酶聚合酶扩增方法的引物及探针,评价该方法的特异度及灵敏度。结果该方法可检测核酸浓度最低为20拷贝/μl,与实时荧光定量PCR方法的检测下限相近,且特异性较好。结论该检测方法操作简单,特异性良好,敏感度高且无需大型精密实验设备,适合现场使用。