牛支原体可视化重组酶聚合酶扩增检测方法的建立

为建立一种对牛支原体高效、快捷的可视化重组酶聚合酶扩增(LFD-RPA)临床诊断方法,以牛支原体uvrc基因序列为靶基因,设计特异性引物和探针,通过筛选引物和探针、优化反应条件,并通过灵敏度、特异性、重复性和临床样本检测试验进行验证。结果显示,该试验建立的牛支原体LFD-RPA最佳引物为F2/R2,最佳反应条件为39℃、 25 min;检测灵敏度可达2.08 copies·μL^(-1),是普通PCR灵敏度的100倍;与滑液囊支原体、沙门氏菌、绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和产气荚膜梭菌之间无交叉反应;重复性稳定;对50份鼻拭子样本进行检测,阳性率为26%,与我国行业标准PCR检测方法的符合率为89.6%。该试验成功建立了牛支原体LFD-RPA检测方法,该方法具有操作简便、快速、高效、敏感等优点,为牛支原体的临床快速诊断提供了技术支撑。

基于重组酶聚合酶扩增技术的牛源性成分快速检测方法

市场中肉类食品掺假的复杂多样化使得监管机构对动物源性成分鉴定的便捷性、准确性、灵敏性要求越来越高。尤其是市场上经济价值较高的牛肉类产品已成为制假的重灾区,迫切需要建立一种快速、高效的牛源性成分分子检测方法。基于此,以牛组成型表达基因β-actin为靶基因设计并筛选了几组牛特异性扩增的引物和探针组合,经过灵敏度检测和特异性验证,建立了一种牛源性成分实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)快速检测方法。通过优化试剂配比,提高了一步法提取牛肉制品DNA的效率,同时将PRA技术与胶体金免疫试纸条显色技术相结合实现了检测的便捷化和结果的可视化。实际应用结果表明,研究建立的牛源性RPA检测方法能够特异性地检测牛源性成分,且最低检测灵敏度可达到14.8个拷贝,通过胶体金免疫试纸条得到的可视化结果的准确性和灵敏度与实时荧光RPA相同。该方法特异性强、灵敏度高,整个过程在25 min内即可完成,极大缩短了检测时间。

重组酶聚合酶扩增技术在动物病原菌检测中的应用进展

体外核酸扩增技术在动物疫病病原检测中应用广泛。重组酶聚合酶扩增(RPA)作为一种新型的核酸等温扩增技术,可在较低温度(37~42℃)下扩增DNA或RNA,具有反应时间短、样品制备量少、特异性和敏感性高等优点。RPA突破了常规聚合酶链反应(PCR)实施时对实验室条件的依赖性,并能高效和灵敏地检测动物疫病病原。基于RPA技术的病原菌检测方法可实现对动物细菌病的现场快速诊断。论文综述了RPA技术的反应体系和条件、反应原理和产物检测方法等,介绍了RPA技术在动物病原菌检测中的应用和潜在价值,以期为动物疾病快速诊断研究提供参考。

重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条技术快速可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌方法的建立与应用

目的:建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)和侧向流动试纸条(lateral flow strips,LFS)的嗜麦芽窄食单胞菌快速可视化检测方法。方法:以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(NC_010943.1)为模板,设计RPA引物。通过基础型RPA反应和琼脂糖凝胶电泳,根据候选引物对的扩增性能及引物二聚体的形成情况筛选最佳引物对。根据最佳引物对,设计探针和修饰引物。在引物和探针中引入碱基错配以消除假阳性信号,建立RPA-LFS反应体系。根据检测线的显色情况,优化RPA-LFS的最佳反应条件。使用临床常见的12种致病菌和12个临床来源的嗜麦芽窄食单胞菌检测该方法的特异性。以10倍梯度稀释的嗜麦芽窄食单胞菌基因组为模板,检测该方法的灵敏度。收集108例临床样本,将该方法与qPCR检测法和生化培养法对比,对RPA-LFS检测法进行kappa一致性检验及临床应用评价。结果:RPA-LFS检测法在37℃恒温条件下8 min即可完成扩增反应,1 min内可在LFS上观察到结果。该方法灵敏度高,最低检出限为1.107 CFU,并且与其他病原菌无交叉反应,特异性强。应用于临床样本检测时,该方法与qPCR相比,检测结果准确性一致。与生化培养方法的符合率为99.07%,kappa指数值为0.972,具有良好的一致性。结论:本研究建立了一种不依赖于精密仪器和专业技术人员的RPA-LFS检测方法,能够短时间内精准鉴定嗜麦芽窄食单胞菌。该方法的建立可为及时制定合理的抗菌治疗方案提供信息,具有较大的临床应用潜力。

塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增技术(RPA)实时荧光检测方法的建立

塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)可感染猪,引起类似口蹄疫病毒感染造成的水疱性病变,新生仔猪病死率达30%~70%。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对SVV 3D基因设计了引物和探针,并进行筛选、反应条件优化以及敏感性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,本方法在40℃、10 min内检测的最低浓度为28拷贝/μL;与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应;通过3次重复试验检测2.8×10~6~2.8×10~1拷贝/μL的6个稀释度样品,在荧光强度达1500 mV所需时间变异系数范围在2.44%~14.95%。该等温、快速扩增方法为猪群出现水疱性疾病的鉴别诊断提供了技术支持,对及时采取适当防控措施具有重要意义。

单核细胞增生李斯特菌重组酶聚合酶恒温扩增快速检测方法的建立

为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的单核细胞增生李斯特菌快速检测方法,本研究针对单增李斯特菌的基因组序列设计特异性引物,通过对反应体系的优化确定最佳反应温度为42℃和最佳反应时间为15 min。特异性试验结果显示:本研究建立的RPA方法与伊氏李斯特菌、无害李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、肠致病性大肠埃希菌O157、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均无交叉反应;敏感性试验结果显示:该方法对单增李斯特菌基因组DNA和菌液的最低检出限分别为3×102拷贝/μL和103 cfu/mL。利用本研究建立的RPA快速检测方法分别对50份人工污染的牛奶、牛肉和鱼肉样品进行检测,并与荧光定量PCR检测结果进行对比,结果一致。本研究建立的单增李斯特菌RPA检测方法具有反应快速、灵敏度高、特异性强、操作简便的特点,适用于基层实验室和现场快速检测。

重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条快速检测新加坡石斑鱼虹彩病毒

为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的方法,本研究针对SGIV特异基因ORF014L序列设计特异性引物及探针,建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)(RPA-LFD)的SGIV检测技术。RPA反应使用10μmol/L的引物浓度,在40.1℃恒温反应20 min即可完成特异性病毒的检测,最低检测限为102个/μL标准质粒。RPA-LFD反应在42℃恒温反应8 min可将检测结果通过试纸条可视化呈现,最低检测限为101个/μL标准质粒,且不与其他常见水生动物病原发生交叉反应,临床样品检测结果也与PCR检测结果一致。RPA、RPA-LFD均能特异性检测SGIV,两者的检测限均比常规PCR灵敏。RPA-LFD法具有快捷简单、结果可视化的特点,在临床应用具有较好的应用前景。

鱼类产品中嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增结合CRISPR/Cas12a快速检测及耐药性分析

目的建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,CRISPR-Cas)新方法,检测鱼类产品中嗜水气单胞菌,并分析其耐药性。方法采用基于最新的CRISPR基因编辑技术建立RPA结合CRISPR/Cas12a新方法,快速检测嗜水气单胞菌,同时采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法比对两种方法的检出率。筛查嗜水气单胞菌分离株的耐药性,采用纸片扩散法测定耐药表型,采用荧光染料(SYBR green,SYBG)实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定耐药基因,分析耐药表型与耐药基因结果的一致性。结果在74例鱼类样品中,基于RPA-CRISPR/Cas12a和LAMP同时检测出6例嗜水气单胞菌。分析耐药性测试结果发现,分离株对5大类10种抗生素的耐药情况差异较大,耐药表型与耐药基因结果一致性较高。结论所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法适用于嗜水气单胞菌快速检测。而细菌耐药性的产生机制比较复杂,耐药表型的产生在一定程度上受耐药基因调控。研究结果为水产品中嗜水气单胞菌快速检测和耐药性筛查提供新思路和方法。

双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

基于实时荧光重组酶聚合酶扩增技术的铜绿假单胞菌快速检测方法的建立

目的 针对铜绿假单胞菌毒力基因exoS,建立一种实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)技术检测方法,并评价该方法的特异性、灵敏度及实用性。方法 根据铜绿假单胞菌毒力基因exoS的特异性保守区域,设计RPA特异性引物和探针,对提取的目标DNA进行检测,确定RPA方法的特异性和灵敏度;建立实时荧光定量PCR(qPCR)法,对目标DNA进行检测,比对不同检测方法对铜绿假单胞菌的检出限;通过临床样本性能验证试验,进一步确定RPA技术检测铜绿假单胞菌的可行性。结果 建立的RPA检测方法特异性良好,仅对铜绿假单胞菌有特异扩增曲线,对其他细菌无特异扩增曲线;RPA方法检测病原菌的灵敏度为5×10^(2) cfu/mL,该方法与qPCR法检出限一致且结果可靠;RPA方法检测时间仅需30 min,明显短于传统方法的检测时间。结论 该研究建立的铜绿假单胞菌RPA检测方法特异性强、灵敏度高,相对于传统检测方法明显缩短检测时间,可用于临床标本中铜绿假单胞菌的快速检测。

铜绿假单胞菌重组酶聚合酶扩增检测方法研究

基于铜绿假单胞菌中高度保守的外毒素A基因设计特异性引物,建立并优化重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)条件,并评价该方法的灵敏度和抗干扰能力。结果显示,RPA反应体系能够在40℃等温条件下,20 min内实现对目标基因的扩增,检出铜绿假单胞菌的灵敏度为10~2 CFU·mL^(-1),抗干扰能力与GB 8538-2022相一致。经培养优化后,铜绿假单胞菌的最低检出限可达10 CFU·mL^(-1),且重复性良好。本研究探索的铜绿假单胞菌RPA扩增检测方法操作简单、反应迅速、抗干扰能力强,为食品中铜绿假单胞菌的快速识别提供了新的方向与参考。

非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法的建立

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对ASFVB646L(p72)基因设计了3组引物和探针,并进行筛选、反应条件优化、灵敏性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,该方法在39℃、20 min内即可检测10个拷贝的DNA分子,且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应,检测5.5×106至5.5×100拷贝/μL共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度,变异系数范围在0.38%~28.30%。该等温、快速扩增方法可用于ASFV的定性检测,为中国ASFV感染的早期诊断提供技术支持,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。

重组酶聚合酶恒温扩增结合乳胶微球试纸条快速检测金黄色葡萄球菌

通过建立一种将重组酶聚合酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与乳胶微球试纸条(latex microsphere test strips,LMTS)相结合的方法,快速检测金黄色葡萄球菌。根据金黄色葡萄球菌保守区序列(nuc)设计特异性引物,经RPA扩增后用LMTS检测,确定RPA-LMTS检测金黄色葡萄球菌的灵敏度和特异性。灵敏度结果显示RPA-LMTS检测限为500 fg DNA和1.2×101 CFU/mL纯菌液;特异性结果表明与沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、志贺氏菌、产气肠杆菌和单增李斯特菌无交叉反应,特异性良好;用食物样品评估RPA-LMTS检测效果,结果显示经过增菌3小时后,RPA-LMTS可检测1.2×100 CFU/mL(g)的金黄色葡萄球菌。

柑桔黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测

为了建立黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)快速检测体系,丰富柑桔黄龙病的高效简便检测方法,以黄龙病菌株psy62全基因组中的单拷贝tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB基因簇序列和5拷贝核糖核苷酸还原酶β亚基基因(nrdB)序列设计并筛选特异性引物,经灵敏度比较和检测特异性验证,建立该病的RPA检测体系,并经PCR、RPA和实时荧光PCR对87份柑桔样品的黄龙病菌进行对比检测,验证RPA检测体系的适用性。结果表明,建立的黄龙病菌RPA检测方法能特异性检测柑桔黄龙病;灵敏度与实时荧光PCR相当,是PCR的100倍;扩增过程只需20 min,大幅提高检测效率;对田间疑似柑桔黄龙病的送检样品检测结果与实时荧光PCR一致,比PCR的检出率高。

一步法逆转录重组酶聚合酶常温扩增技术(RT-RPA)检测大豆花叶病毒

大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)是一种在全世界广泛分布并且破坏性极大的植物病毒,可以导致大豆产量骤减以及种质的衰退,为此,建立了快速灵敏的一步法逆转录重组酶聚合酶扩增检测技术(RT-RPA),利用该技术可以快速、准确、有效地检测大豆中携带的SMV。根据Gen Bank数据库中SMV的外壳蛋白基因序列,设计RPA特异性引物,采用SMV、BPMV、SBMV、Ar MV及TRSV共5种病毒进行RT-RPA特异性验证;并设计5个模板浓度梯度,验证RT-RPA方法的灵敏性。结果显示,建立的RT-RPA检测方法能够从SMV样品中检测到154 bp的特异性条带;特异性验证试验表明除SMV能检测到特异性条带以外,其他4种病毒BPMV、SBMV、Ar MV及TRSV均未检测到条带;RT-RPA检测SMV的灵敏度达到10-4稀释度。综上所述,本研究建立的RT-RPA方法检测SMV特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合实验室或者现场快速检测。

重组酶聚合酶扩增技术研究进展

重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术是一种新兴的核酸恒温扩增技术,具有灵敏度高、特异性强、反应快速等特点。利用RPA技术可以对核酸拷贝数进行绝对定量并且可以同时检测多个靶标核酸序列,结合侧流层析试纸条或荧光信号监测装置等简易实验设备即可直接观察检测结果。就RPA技术的原理、发展、技术特点及其近年来在体外诊断、病原检测等领域的研究进展作一综述,旨在为该技术的深入研究和应用提供参考。

重组酶聚合酶扩增技术及其在寄生虫检测中的应用

重组酶聚合酶扩增技术（RPA）是以T4噬菌体体内核酸复制机制为原理，以多种蛋白及酶参与的一种新型核酸等温扩增技术，可在37--42qC条件下，20min内将核酸扩增至可检测水平。具有较高的敏感性和特异性，且操作简单，可在非实验室条件下实现对核酸的快速检测。自2006年问世后，已广泛应用于农业、食品安全、医学和转基因检测等多个领域。本文综述了RPA技术的研究进展及其在寄生虫检测中的应用。

塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测方法的建立

为建立塞尼卡谷病毒(SVV)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对SVV 3D基因设计了引物和探针,通过反应条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了SVV RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒无交叉反应;在40℃、20 min内可检测的最低浓度为56拷贝/μL质粒标准品;通过3次重复试验检测,LFD检测线灰度值变异系数范围在4.49%~9.73%。利用该方法对120份国内临床样品进行检测,结果均为阴性。本研究首次建立了检测SVV的等温、快速RPA-LFD方法,读取结果不依赖任何仪器设备,为猪群感染SVV的现场快速诊断、流行病学研究和根除方案的制定提供帮助。

重组酶聚合酶扩增技术在疾病快速检测中的研究进展

重组酶聚合酶扩增技术（RPA）是近年来开发的核酸扩增技术,在保证灵敏、特异的同时,操作简单、耗时短,能够在常温下10~20分钟内对靶DNA进行扩增,对实验设备、资源的要求低,适用于兽医、食品安全、生物防御、农业等领域的快速诊断。本文介绍了该技术的原理及目前在病毒、细菌、寄生虫等病原检测方面的应用,展望了其现场检测方面的应用前景。

基于重组酶聚合酶扩增技术的犬细小病毒快速检测方法的建立

为建立一种快速、简便检测犬细小病毒(CPV)的方法,本研究基于CPV VP2基因的保守序列,设计合成引物,通过对反应条件的优化,建立了CPV的重组酶聚合酶(RPA)检测方法。该方法在38℃恒温反应15 min即可快速、特异性的检测出CPV。特异性试验结果显示,除CPV (BJ-2b株、BJ-2c株)外,犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒等检测均为阴性;敏感性试验结果显示,以重组质粒pEASY-CPV-VP2为模板,RPA的检测下限为1×10~1拷贝/μL,其敏感度比普通PCR方法高10倍。利用建立的RPA方法对疑似CPV感染的临床样品的阳性检出率为88%,高于普通PCR的检出率(82%)和胶体金的检出率(76%)。本研究建立的CPV RPA检测方法操作简单,反应灵敏,结果确实可靠,适用于CPV的快速检测。