动态浊度法检测细菌内毒素含量在重组铜绿假单胞菌外毒素A制备中的应用

目的:应用动态浊度法监测重组铜绿假单胞菌外毒素A(r EPA)制备各阶段料液中的细菌内毒素含量,为其工艺优化和质量控制提供依据。方法:参考应用《中华人民共和国药典》2015年版三部载录的动态浊度法测定细菌内毒素含量,对该方法的专属性、精密度、重现性、准确性和标准曲线的可靠性进行了验证,并将该方法应用于r EPA制备各阶段料液中细菌内毒素含量的测定及细菌内毒素去除效果的评价。结果:该方法具有较好的专属性、精密度、重现性、准确性。结论:经方法验证显示该方法的专属性、精密度、重现性、准确性等技术参数达到了相关验证要求,结果稳定可靠。现有r EPA制备工艺能稳定、有效地去除细菌内毒素,纯化后r EPA中细菌内毒素含量较低。本研究为r EPA制备过程中细菌内毒素去除效果的评价提供了准确的参考数据。

免疫单扩散法测定重组铜绿假单胞菌外毒素A蛋白含量方法的建立及其应用

目的:探索建立免疫单扩散法测定不同料液中重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,r EPA)蛋白含量新方法。方法:对缓冲液系统、最佳抗体浓度和最佳观测时间等关键因素进行摸索,确定方法的最佳条件。在此基础上,对该方法的专属性、精密度、准确性和标准曲线的可靠性进行验证,并将该方法应用于r EPA柱层析纯化中不同样品目标蛋白含量的测定及回收率计算。结果:最佳缓冲系统为0.85%Na Cl溶液,最佳抗体用量为50μL·m L-1,最佳观测计算时间为4 h。方法具有较好的专属性、精密度、准确性和线性。结论:初步建立了免疫单扩散试验测定不同料液中r EPA蛋白含量新方法,为其纯化工艺的优化奠定了基础。

重组铜绿假单胞菌外毒素A含量SDS-PAGE检测方法的建立及验证

目的建立测定重组铜绿假单胞菌外毒素A（recombinant exotoxin of Pseudomonas aeruginosa,r EPA）含量的SDSPAGE法,并进行验证。方法采用SDS-PAGE,经考马斯亮蓝R-250染色后,利用Image Lab软件分析获得目标蛋白条带光密度值,计算目标蛋白在待测样品中的含量。对建立的方法进行专属性、准确性和重复性验证,确定检测范围,并用建立的方法检测r EPA宿主湿菌体中r EPA发酵产量及r EPA宿主菌休克液柱层析纯化样品中r EPA含量。结果 r EPA含量在100~600μg/ml范围内与其对应条带的光密度值具有良好的相关性,决定系数在0.97以上。大肠埃希菌固有组分及纯化过程中常用的添加物对r EPA含量检测均未产生明显影响,专属性较好;用建立的方法检测500、300、150μg/ml r EPA样品10次的回收率分别为（102.32±4.18）%、（102.77±4.94）%和（95.04±16.41）%,CV值分别为4.08%、4.81%和17.27%。各批r EPA发酵产量为250~500 mg/L,三步柱层析纯化后,r EPA总回收率约为50%。结论建立了测定r EPA含量的SDS-PAGE法,该方法专属性、准确性和重复性良好,为r EPA生产工艺的优化奠定了基础。

工程菌种子制备方法对rEPA表达量影响的研究

由重组E.colirPE553D所表达的基因缺失突变脱毒的重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA),目前大量以载体蛋白用于多种细菌多糖蛋白结合疫苗研究。rEPA的表达量受众多因素的影响,种子的制备方式就是重要因素之一。本文用长期冷冻保存的和新鲜提取的质粒分别转化宿主菌E.coliBL21(λDE3)后制备种子,并将它们和冻干保存的E.colirPE553D在相同条件下培养和诱导,经SDS-PAGE分析表明长期保存的质粒转化宿主后的重组工程菌生长速度较慢,但rEPA的表达量和新鲜质粒转化制备的工程菌基本相同,而冻干保存的工程菌E.colirPE553D几乎丧失了表达rEPA的能力。