重组雌激素受体基因酵母细胞检测牛尿液中β-雌二醇残留的方法

为探索畜禽产品中雌激素残留的检验方法,加强对畜禽生产过程中激素添加的监控,本研究选择了在我国几种常见影响比较大的合成雌激素-β-雌二醇(E2)为研究对象,建立用于测定动物尿液中雌激素的重组基因酵母检测法。结果表明本方法简单、有效,能够作为雌激素残留检测体系的有益补充。

酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母

应用酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母,用以检测类/抗雌激素化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.采用多聚酶链反应(PCR)法扩增人雌激素受体(hER)基因,构建诱饵质粒pGBKT7-ER LBD;分别提取并纯化两种含有ER共激活因子基因的靶质粒pGAD424-GRIP1和pGAD424-SRC1;诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞Y187,于营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)上筛选阳性菌落,分别构建两种ER双杂交酵母ER+GRIP1和ER+SRC1.考察双杂交酵母与不同激素:17β-雌二醇(E2)、二氢睾酮(DHT)、孕酮(PG)以及三碘甲状腺原氨酸(T3)的结合情况,并考察了雌激素受体拮抗剂4-羟基他莫昔芬(4-OHT)与酵母的相互作用.结果表明:ER+GRIP1和ER+SRC1酵母均能够专一性的和E2结合,并存在显著的剂量-效应关系,E2对ER+GRIP1和ER+SRC1酵母β-半乳糖苷酶活性诱导的EC50值分别为7.3×10-11mol·L-1和1.5×10-10mol·L-1,其中ER+GRIP1酵母细胞诱导产生的酶活性值明显高于ER+SRC1酵母细胞.4-OHT能够抑制E2诱导ER+GRIP1酵母细胞产生的酶活性,并存在显著的剂量-效应关系,IC50值为1.0×10-7mol·L-1.表明重组人雌激素受体基因酵母可以用于检测化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.

重组基因酵母检测环境类雌激素污染物

介绍了利用重组基因酵母细胞检测环境类雌激素污染物的生物测定方法,并利用这种方法测定污泥、土壤、底泥、飘尘和家庭炉灶燃烧过程中排放的污染物中的雌激素活性,研究了样品不同的纯化方法对雌激素活性的影响.结果表明,重组受体基因/报道基因的酵母检测技术是一种筛选和定量分析环境样品中雌激素类污染物的快速、有效方法.酵母检测应结合分离纯化步骤,除去样品中的非活性和对酵母细胞有毒性的干扰物质.

检测饮用水中雌激素物质的方法——结合S9代谢活化的重组基因酵母法

采用将大鼠肝脏微粒体酶系统（S9）代谢活化体系和重组基因酵母测试体系相结合的方法检测饮用水中的间接雌激素物质。通过对双酚A代谢活化前后的活性对比,优化了S9代谢活化方法,并将该方法应用于南方某水厂饮用水处理工艺样品的雌激素效应检测。研究表明水样中存在间接雌激素效应物质,经S9代谢活化后可检出其活性。原水中的间接雌激素物质在混凝、砂滤两工艺段得到有效去除。检测标准样品和实际样品的应用研究表明,重组基因酵母检测方法结合S9代谢活化步骤简单、方便,更全面地反映了样品潜在的雌激素水平,有望在水质安全评价上得到广泛的应用。

基因重组酵母细胞检测养殖场污水中环境雌激素

用细胞生物学分析方法,对某养殖场污水处理厂水样中的类雌激素活性进行了分析,其中处理前水样6份,处理后水样9份。水样中的雌激素类化合物分别用大孔树脂富集,依次用丙酮、甲醇、乙醚洗脱,洗脱液经水浴蒸发挥干并用二甲亚砜定容。用重组人雌激素受体酵母细胞测其类雌激素活性,报告基因为编码β-半乳糖苷酶的LacZ基因。结果发现,处理前水样雌激素活性较高,而处理后水样对β-半乳糖苷酶的诱导水平较低。经17β雌二醇(E2)标准曲线换算成雌二醇当量,发现处理前水样雌激素活性在0.0001至0.15nmol·L-1E2当量,而处理后水样雌激素活性明显下降,有17个水样雌激素活性低于检出限,这说明畜牧厂污水中的雌激素类化合物通过污水处理厂处理后可下降。

重组孕激素受体基因酵母法对南山茶子拮抗孕激素作用的研究

目的研究南山茶子拮抗孕激素作用。方法用系统溶剂分离法将南山茶子醇提物分成极性不同的组分,利用重组人孕激素受体基因酵母生物检测法筛选南山茶子拮抗孕激素活性部位。结果5个组分都表现出拮抗孕激素的效应,活性强弱依次为醋酸乙酯层>正丁醇层>石油醚层>水层>醇提物。结论醋酸乙酯部位可能为南山茶子拮抗孕激素的活性部位。

基因重组酵母细胞测定中药中雌激素类化合物的研究

目的:研究不同性味中药中植物性雌激素的含量。方法:用重组人雌激素受体(hER)基因酵母细胞(W 303-1A/hER-ERE-LacZ)测定清热药、解表药、利水渗湿药、止血药、补益药、收涩药中的植物性雌激素的活性。通过定量测定β-半乳糖苷酶活性表示中药的雌激素强度。结果:清热药中雌激素含量最高,为6.35×10-3nmol.g-1,止血药与补益药中雌激素含量较低,几乎测不出。结论:虎杖、连翘、秦皮、黄芩、麦冬中可与雌激素受体结合的植物性雌激素含量较高。

重组基因酵母法研究酞酸酯类化合物的类雌激素作用

为了检测五种酞酸酯类化合物的类雌激素活性,采用重组人雌激受体α、相关效应元件以及β-半乳糖苷酶报告基因酵母分别测定17β-雌二醇（E）2、邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二辛酯（DOP）、邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）单独作用时诱导酶活并计算其EC50。通过各化合物与E2的EC50的比以及最大β-半乳糖苷酶活性来比较酞酸酯类化合物的类雌激素活性。五种酞酸酯类化合物的实验浓度范围为1.0×10^-3-1.0×10^-11 mol/L。结果表明,DEP（1×10^-7-1×10^-9 mol/L）、DBP（1×10^-6－1×10^-9 mol/L）、BBP（1×10^-3－1×10^-6 mol/L）具有明显的类雌激素活性,诱导的最大酶活分别为：1.515、0.832 2、1.669,而DMP和DOP并未检出明显的类雌激素活性。DEP、DBP、BBP与E2的EC50的比分别为8.85×10-2、2.54×10^-2、8.82×10^-6。说明DEP、DBP在低浓度就表现出类雌激素活性,而BBP在较高浓度才表现出类雌激素活性。

人雌激素受体cDNA在酵母细胞中的表达

根据人全长雌激素受体cDNA序列,用RT-PCR方法使乳腺癌细胞MCF-7株扩增人雌激素受体基因(hERcDNA),通过pGEM-T/hER载体克隆到酵母表达载体中,并转化到酿酒酵母细胞中,用Westernblot法和免疫组化法检测hERcDNA的表达。结果表明:hERcDNA在酵母细胞中成功表达,可用于建立环境雌激素的酵母细胞检测体系。

改进型重组基因酵母TR-GRIP1检测化合物甲状腺激素干扰活性

应用酵母双杂交技术构建重组TR(甲状腺激素受体)基因酵母,用以检测类抗甲状腺激素化合物及环境样品的甲状腺激素干扰活性.提取并纯化含有TR基因的酵母表达质粒pGBT9-TR以及含有TR共激活因子GRIP1基因的酵母表达质粒pGAD424-GRIP1,将pGBT9-TR和pGAD424-GRIP1同时转化至酵母细胞Y187,以营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)筛选阳性菌落,构建TR-GRIP1双杂交酵母.考察该酵母与天然甲状腺激素——T3(三碘甲状腺原氨酸)的结合情况,确定最佳暴露时间,建立剂量-效应关系曲线.结果表明:TR-GRIP1双杂交酵母能够与T3结合诱导β-半乳糖苷酶活性,选择暴露时间为2 h,T3诱导酶活性的EC50值为1.1×10-7 mol/L;构建的重组基因酵母TR-GRIP1提供了检测化合物甲状腺激素干扰活性的新方法.

化学物质的Ah受体效应重组基因酵母检测法的优化

接有芳香烃受体 (AhR)基因和芳香烃受体核转位子蛋白 (ARNT)基因的酵母Saccharomycescerevisiae菌株是测定化学物质的Ah受体效应的方法之一 .本实验通过优化各个实验条件 ,发现用 0 2 %葡萄糖作前培养液培养菌 2 4h ,用 2 %半乳糖作化学物质暴露时的培养液 ,暴露在玻璃管时 ,暴露时间从原来的 1 8h缩短到 8h .并用已经优化的方法测定了六氯苯和五氯苯的Ah受体效应 ,得出六氯苯和五氯苯相对于TCDD的毒性等当量值 (TEF)分别为 0 0 1 86 2 9和 0 0 0 0 2 94 .

应用重组基因酵母法检测松花江吉林段土壤有机组分甲状腺激素干扰效应

利用重组甲状腺激素受体（TR）基因酵母，结合土壤样品索氏提取、富集和净化方法，检测松花江吉林段土壤有机组分甲状腺激素干扰效应及其分布特征。测试结果表明：所有样点均未检测出TR诱导效应；部分样点检测出TR抑制效应，检出率为56．25％，最大抑制率为46．00％；采用RIC20值（抑制率为20％时每孔所需要的土壤量，以mg计）表征样点的抑制效应，其RIC20值为0．81～5．34，表明松花江吉林段土壤中存在TR抑制效应污染物，可能具有潜在的环境危害。研究土壤甲状腺激素干扰效应的分布特征发现研究区甲状腺激素干扰效应分布与产业布局相关，TR抑制效应较高的样点主要集中在工业区及养殖区，表明TR抑制效应物质可能来源于工业污染或畜产养殖污染。通过本研究探明了松花江吉林段土壤有机组分的甲状腺激素干扰特征，为该地区土壤污染防治以及风险评价提供了基础的毒理学数据。

菲律宾蛤仔雌激素相关受体基因克隆及互作蛋白筛选

采用RACE技术克隆鉴定了菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)雌激素相关受体(rpERR)基因的cDNA序列。rpERR基因全长序列为2 340 bp,开放阅读框ORF为1 453 bp,编码484个氨基酸,理论分子量为54.5 kDa。氨基酸序列同源性分析表明菲律宾蛤仔ERR与脊椎动物ERRγ同源性相近,与其他无脊椎动物聚为一个分支,与虾夷扇贝的ERR同源性最高。rpERR含有核受体超家族通常的6个结构域。通过qRT-PCR技术检测发现ERR在菲律宾蛤仔的鳃、消化盲囊、性腺、闭壳肌和外套膜组织中各组织中均有表达,在性腺中的表达量最高。运用酵母双杂交技术对菲律宾蛤仔酵母cDNA文库进行互作蛋白筛选、测序及生物信息学分析,获得了菲律宾蛤仔ERR互作蛋白为cAMP应答元件结合蛋白。根据rpERR的生物信息学分析、各组织中表达特征以及互作蛋白推测其功能可能涉及性腺发育与物质能量代谢等重要生物学过程的调节。

环境雌激素调控的β-半乳糖苷酶酵母细胞的建立

为建立环境雌激素的酵母评价体系,将人工合成的雌激素效应元件插入pM P 206质粒的上游,并将该质粒转入人雌激素受体基因重组酵母细胞,使L acZ基因置于雌激素的调控之下,以构建可用于评价环境雌激素的酵母细胞。结果表明:经DNA测序发现pM P 206/ERE-L acZ报告质粒DNA框架正确,对转化子进行PCR鉴定,发现有雌激素受体基因和pM P 206/ERE-L acZ报告质粒的特异性条带,说明雌激素受体基因和受雌激素调控的L acZ报告基因已重组于酵母细胞,从而证明以L acZ为报告基因的环境雌激素酵母评价细胞重组成功。

雌激素调控的绿色荧光蛋白在酵母细胞中的表达

采用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,用酵母细胞构建环境雌激素(EEH)的评价体系,可敏感、快速、方便地筛选出EEH化合物。通过分子生物学技术,将GFP基因插入到pM P 206/ERE启动子CYC 1的下游,用GFP取代L ac Z基因,并转化于酵母细胞。DNA测序发现ERE-CYC 1-GFP框架正确。对转化子进行PCR鉴定,发现有雌激素受体基因(hER cDNA)和GFP基因特异条带,说明hER cDNA和GFP已重组于酵母细胞。荧光显微镜下发现大量的绿色荧光颗粒,表明GFP基因在酵母细胞中成功表达。酵母细胞经不同浓度雌二醇作用后,与GFP表达量有剂量效应关系。与其他酵母评价体系相比,以GFP为报告基因评价EEH不需要破坏细胞壁,也不需要底物,可在96孔板中完成,这为高通量筛选EEH化合物奠定了基础。

重组基因酵母报道系统筛检GR效应物质

用糖皮质激素受体重组基因酵母报道系统对3种天然与4种合成的糖皮质激素的糖皮质激素受体(GR)效应进行测定.结果表明,天然糖皮质激素中,肾上腺酮的活性最高;而合成激素中甲基强的松的活性最强.这些物质的GR效应与物质的化学结构密切相关.天然和合成糖皮质激素的GR效应随各自的辛醇水分配系数的增加而增强.

人雌激素受体相关受体逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建人雌激素受体相关受体α(hERRα)逆转录病毒载体。方法用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pSG-hERRα质粒和pLXSN空白质粒,采用凝胶DNA回收方法回收纯化hERRα片段,用T4连接酶进行连接反应,构建成PLXSN-neo-hERRα重组体。结果经PCR、酶切鉴定、测序等对重组体进行鉴定,证实构建的重组体方向、序列正确。结论已成功构建hERRα逆转录病毒载体,为研究hERRα的功能奠定了基础。