重组雌激素受体基因酵母细胞检测牛尿液中β-雌二醇残留的方法

为探索畜禽产品中雌激素残留的检验方法,加强对畜禽生产过程中激素添加的监控,本研究选择了在我国几种常见影响比较大的合成雌激素-β-雌二醇(E2)为研究对象,建立用于测定动物尿液中雌激素的重组基因酵母检测法。结果表明本方法简单、有效,能够作为雌激素残留检测体系的有益补充。

酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母

应用酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母,用以检测类/抗雌激素化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.采用多聚酶链反应(PCR)法扩增人雌激素受体(hER)基因,构建诱饵质粒pGBKT7-ER LBD;分别提取并纯化两种含有ER共激活因子基因的靶质粒pGAD424-GRIP1和pGAD424-SRC1;诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞Y187,于营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)上筛选阳性菌落,分别构建两种ER双杂交酵母ER+GRIP1和ER+SRC1.考察双杂交酵母与不同激素:17β-雌二醇(E2)、二氢睾酮(DHT)、孕酮(PG)以及三碘甲状腺原氨酸(T3)的结合情况,并考察了雌激素受体拮抗剂4-羟基他莫昔芬(4-OHT)与酵母的相互作用.结果表明:ER+GRIP1和ER+SRC1酵母均能够专一性的和E2结合,并存在显著的剂量-效应关系,E2对ER+GRIP1和ER+SRC1酵母β-半乳糖苷酶活性诱导的EC50值分别为7.3×10-11mol·L-1和1.5×10-10mol·L-1,其中ER+GRIP1酵母细胞诱导产生的酶活性值明显高于ER+SRC1酵母细胞.4-OHT能够抑制E2诱导ER+GRIP1酵母细胞产生的酶活性,并存在显著的剂量-效应关系,IC50值为1.0×10-7mol·L-1.表明重组人雌激素受体基因酵母可以用于检测化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.

基因重组酵母细胞检测养殖场污水中环境雌激素

用细胞生物学分析方法,对某养殖场污水处理厂水样中的类雌激素活性进行了分析,其中处理前水样6份,处理后水样9份。水样中的雌激素类化合物分别用大孔树脂富集,依次用丙酮、甲醇、乙醚洗脱,洗脱液经水浴蒸发挥干并用二甲亚砜定容。用重组人雌激素受体酵母细胞测其类雌激素活性,报告基因为编码β-半乳糖苷酶的LacZ基因。结果发现,处理前水样雌激素活性较高,而处理后水样对β-半乳糖苷酶的诱导水平较低。经17β雌二醇(E2)标准曲线换算成雌二醇当量,发现处理前水样雌激素活性在0.0001至0.15nmol·L-1E2当量,而处理后水样雌激素活性明显下降,有17个水样雌激素活性低于检出限,这说明畜牧厂污水中的雌激素类化合物通过污水处理厂处理后可下降。

基因重组酵母细胞测定中药中雌激素类化合物的研究

目的:研究不同性味中药中植物性雌激素的含量。方法:用重组人雌激素受体(hER)基因酵母细胞(W 303-1A/hER-ERE-LacZ)测定清热药、解表药、利水渗湿药、止血药、补益药、收涩药中的植物性雌激素的活性。通过定量测定β-半乳糖苷酶活性表示中药的雌激素强度。结果:清热药中雌激素含量最高,为6.35×10-3nmol.g-1,止血药与补益药中雌激素含量较低,几乎测不出。结论:虎杖、连翘、秦皮、黄芩、麦冬中可与雌激素受体结合的植物性雌激素含量较高。

人雌激素受体cDNA在酵母细胞中的表达

根据人全长雌激素受体cDNA序列,用RT-PCR方法使乳腺癌细胞MCF-7株扩增人雌激素受体基因(hERcDNA),通过pGEM-T/hER载体克隆到酵母表达载体中,并转化到酿酒酵母细胞中,用Westernblot法和免疫组化法检测hERcDNA的表达。结果表明:hERcDNA在酵母细胞中成功表达,可用于建立环境雌激素的酵母细胞检测体系。

重组基因酵母检测环境类雌激素污染物

介绍了利用重组基因酵母细胞检测环境类雌激素污染物的生物测定方法,并利用这种方法测定污泥、土壤、底泥、飘尘和家庭炉灶燃烧过程中排放的污染物中的雌激素活性,研究了样品不同的纯化方法对雌激素活性的影响.结果表明,重组受体基因/报道基因的酵母检测技术是一种筛选和定量分析环境样品中雌激素类污染物的快速、有效方法.酵母检测应结合分离纯化步骤,除去样品中的非活性和对酵母细胞有毒性的干扰物质.

高通量筛选雌激素类化合物重组绿色荧光蛋白酵母细胞测评体系

以载体双表达的方式构建重组酵母环境雌激素的评价体系,用于快速筛选雌激素类化合物。在表达载体中,用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)启动子驱动α人雌激素受体基因(hERα)的表达;在报告载体中,用雌激素效应元件(ERE)调控的绿色荧光蛋白(yEGFP)作为报告基因。将两者转化于酵母细胞(W303-1A)中,构建成重组绿色荧光蛋白酵母细胞。该酵母细胞经不同浓度的雌激素类化合物作用后,发现GFP的表达量与此类受试物具有明显的剂量效应关系。与其他环境雌激素酵母评价体系相比,该重组酵母评价细胞,在应用时不需要破坏细胞壁,也不需要底物和相关试剂,可直接在96孔板中操作完成,具有快速、高通量、敏感性高、重现性好及廉价等特点。

检测饮用水中雌激素物质的方法——结合S9代谢活化的重组基因酵母法

采用将大鼠肝脏微粒体酶系统（S9）代谢活化体系和重组基因酵母测试体系相结合的方法检测饮用水中的间接雌激素物质。通过对双酚A代谢活化前后的活性对比,优化了S9代谢活化方法,并将该方法应用于南方某水厂饮用水处理工艺样品的雌激素效应检测。研究表明水样中存在间接雌激素效应物质,经S9代谢活化后可检出其活性。原水中的间接雌激素物质在混凝、砂滤两工艺段得到有效去除。检测标准样品和实际样品的应用研究表明,重组基因酵母检测方法结合S9代谢活化步骤简单、方便,更全面地反映了样品潜在的雌激素水平,有望在水质安全评价上得到广泛的应用。

XW630对大鼠成骨细胞雌激素受体基因表达的影响

探讨抗骨质疏松新化合物 XW6 30促进成骨作用的机理。从 SD大鼠颅骨中分离培养成骨细胞 ,首次采用具有高灵敏度的逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)技术直接从大鼠成骨细胞中检测雌激素受体 m RNA的表达。结果表明 ,XW6 30具有促进成骨细胞 ERm RNA表达的作用 ,且呈时间依赖性。在相同浓度 (10 - 6 mol/ L)条件下 ,XW6 30作用强于四环素加哌嗪雌酮及单纯雌酚酮。XW6 30可能通过对

重组孕激素受体基因酵母法对南山茶子拮抗孕激素作用的研究

目的研究南山茶子拮抗孕激素作用。方法用系统溶剂分离法将南山茶子醇提物分成极性不同的组分,利用重组人孕激素受体基因酵母生物检测法筛选南山茶子拮抗孕激素活性部位。结果5个组分都表现出拮抗孕激素的效应,活性强弱依次为醋酸乙酯层>正丁醇层>石油醚层>水层>醇提物。结论醋酸乙酯部位可能为南山茶子拮抗孕激素的活性部位。

雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响

背景:雌激素受体β基因参与骨代谢的研究较少,其对骨代谢的具体调节机制仍不清楚。目的:分析雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响。方法:实验分3组:空白对照组(即h FOB 1.19,未感染任何反转录病毒)、阴性对照组(即含无效干扰片断雌激素受体β-sh RNA-nc)、最佳RNAi组(即ERβ-sh RNA-3)。将前期最佳RNAi组的雌激素受体β-sh RNA反转录病毒载体感染人成骨细胞,通过抗性筛选并扩大培养,利用MTT法检测雌激素受体β稳定抑制后对细胞增殖的影响;随后在雌激素干预下,通过Western blot技术检测雌激素受体β蛋白表达的稳定抑制效率,并使用半定量RT-PCR和Western blot技术检测雌激素受体β稳定抑制后对转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响。结果与结论:(1)成功筛选出稳定感染ERβ-shR NA-3反转录病毒载体的人成骨细胞,MTT法检测显示雌激素受体β稳定抑制后对细胞的增殖没有明显影响(P>0.05);(2)在雌激素干预下,雌激素受体β蛋白的抑制率为(93.11±0.57)%(P<0.05),且雌激素受体β稳定抑制后对转化生长因子β1 mR NA和蛋白的上调率分别为(26.65±3.81)%和(23.79±3.76)%,骨形态发生蛋白2 mR NA和蛋白的上调率分别为(16.62±1.71)%和(18.08±3.20)%(均P<0.05);(3)结果提示雌激素受体β可能通过调控转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2的表达在骨代谢中发挥作用。

重组基因酵母法研究酞酸酯类化合物的类雌激素作用

为了检测五种酞酸酯类化合物的类雌激素活性,采用重组人雌激受体α、相关效应元件以及β-半乳糖苷酶报告基因酵母分别测定17β-雌二醇（E）2、邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二辛酯（DOP）、邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）单独作用时诱导酶活并计算其EC50。通过各化合物与E2的EC50的比以及最大β-半乳糖苷酶活性来比较酞酸酯类化合物的类雌激素活性。五种酞酸酯类化合物的实验浓度范围为1.0×10^-3-1.0×10^-11 mol/L。结果表明,DEP（1×10^-7-1×10^-9 mol/L）、DBP（1×10^-6－1×10^-9 mol/L）、BBP（1×10^-3－1×10^-6 mol/L）具有明显的类雌激素活性,诱导的最大酶活分别为：1.515、0.832 2、1.669,而DMP和DOP并未检出明显的类雌激素活性。DEP、DBP、BBP与E2的EC50的比分别为8.85×10-2、2.54×10^-2、8.82×10^-6。说明DEP、DBP在低浓度就表现出类雌激素活性,而BBP在较高浓度才表现出类雌激素活性。

LRP16基因通过雌激素受体α介导抑制Ishikawa细胞中E-钙黏着素的转录活性

目的:既往研究表明LRP16基因过表达通过下调E-钙黏着素促进子宫内膜癌Ishikawa细胞的侵袭生长,本研究目的在于探讨LRP16基因下调E-钙黏着素的分子途径。方法:用免疫组化方法检测LRP16基因过表达的Ishikawa细胞中E-钙黏着素的表达;用共转染与荧光素酶实验检测LRP16基因对E-钙黏着素启动子转录活性的影响;用染色质免疫共沉淀实验检测雌激素受体α(ERα)与LRP16蛋白在E-钙黏着素启动子区的招募状况。结果:E-钙黏着素在LRP16过表达的Ishikawa细胞中的表达水平明显下调;LRP16抑制了E-钙黏着素启动子的转录活性,该效应呈现对雌激素(E2)存在的依赖性特征;LRP16本身没有与E-钙黏着素启动子区结合,但明显抑制了ERα与E-钙黏着素启动子区的结合。结论:LRP16通过抑制ERα对E-钙黏着素基因的转录激活活性,下调E-钙黏着素在Ishikawa细胞中的表达水平。

大豆苷元对HEC-1B细胞增殖及雌激素受体报告基因表达的影响

目的探讨大豆苷元对子宫内膜癌细胞增殖的影响及其对雌激素受体报告基因表达的影响。方法体外培养子宫内膜癌细胞子宫内膜癌雌、孕激素受体阴性细胞系(HEC-1B),采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测不同浓度大豆苷元对子宫内膜癌细胞增殖的影响,同时检测大豆苷元对雌激素应答原件(ERE)调控的雌激素受体α(ERα)和雌激素受体β(ERβ)的荧光素酶报告基因表达的影响。结果大豆苷元对HEC-1B细胞体外增殖有明显抑制作用,差异有统计学意义(P<0.01),其抑制作用有明显量效和时效性特征。在浓度为20～80×10-6mol/L的大豆苷元作用下,报告基因luc的表达较正常对照组明显提高,差异有统计学意义(P<0.05),在80×10-6mol/L时到达最高值;大豆苷元通过ERβ介导的报告基因表达水平的升高程度强于ERα,差异有统计学意义(P<0.01)。结论大豆苷元可通过调节子宫内膜癌细胞ERα和ERβ介导的报告基因的表达,调整ERα/ERβ比例,从而抑制子宫内膜癌细胞的增殖。

过表达雌激素相关受体α干预沉默Bak1、Bcl2重组腺病毒载体转染MG63细胞的增殖与分化

背景:雌激素缺乏是绝经后骨质疏松症的主要发病机制,而关于雌激素相关受体α(estrogen-relatedreceptor alpha,ERRα)与骨质疏松症的相关性研究较少,ERRα在骨质疏松症中的具体作用及其机制在目前尚不明确。目的:研究过表达ERRα对沉默Bak1、Bcl2重组腺病毒载体转染的MG63细胞和相关蛋白的影响。方法:构建过表达ERRα和沉默Bak1、Bcl2腺病毒载体,将培养好的MG63细胞分成空载病毒组、Ad-shBak1组、Ad-sh Bcl2组、Ad-shBak1+shBcl2组,过表达ERRα进行干预。MTT法检测细胞增殖,考马斯亮蓝蛋白定量检测碱性磷酸酶活性,流式法测定钙离子浓度,Western blot法分析骨调节蛋白(骨形态发生蛋白4、结缔组织生长因子、骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、肿瘤坏死因子α)的表达。结果与结论:(1)与空载病毒组对比,Ad-shBak1组的细胞活性、碱性磷酸酶活性均升高,钙离子浓度降低,各骨调节蛋白除肿瘤坏死因子α降低外,其余均升高;Ad-shBcl2组细胞活性、碱性磷酸酶活性、结缔组织生长因子均降低,但无显著性意义(P> 0.05),钙离子浓度、骨形态发生蛋白4、Runt相关转录因子2均降低,骨桥蛋白、肿瘤坏死因子α显著升高(P <0.01);Ad-shBak1+shBcl2组的细胞活性、碱性磷酸酶活性稍升高,钙离子浓度稍降低,各骨调节蛋白水平均升高,但差异不明显(P> 0.05);(2)与Ad-sh Bcl2组比较,Ad-shBak1组与Ad-shBak1+shBcl2组细胞活性、碱性磷酸酶活性升高,钙离子浓度显著降低,除肿瘤坏死因子α水平显著降低外,其余骨调节蛋白水平显著升高(P <0.01或P <0.05);(3)结果提示,过表达ERRα可提高重组腺病毒Bak1转染后的MG63细胞增殖和碱性磷酸酶活性,降低钙离子浓度,且对骨调节蛋白有一定影响作用。

雌激素α受体基因多态性对原发性胆汁性肝硬化Th_1、Th_2类细胞因子表达的影响

目的:探究雌激素α受体基因多态性对原发性胆汁性肝硬化Th1、Th2类细胞因子表达的影响,为临床诊治提供依据。方法:选取34名原发性胆汁性肝硬化患者为研究对象,检测其雌激素α受体基因以及Th1、Th2类细胞因子表达情况,并与正常人结果进行对比分析,为临床诊治提供依据。结果:肝严重损害患者的IL-4、IL-10含量与肝轻度损害患者无明显差异,无统计学意义(P>0.05),其含量与r谷氨酰转移酶以及碱性磷酸酶(GGT、ALP)呈正相关;而肝严重损害者IL-2和TNF-α的含量明显高于肝轻度损害者,有统计学意义(P<0.05),其含量与GGT、ALP呈负相关。雌激素α受体基因中的Pp基因是肝硬化发病的易感基因,Xbal和PvuII基因的多态性会增加雌激素受体的转录翻译,增加雌激素受体的含量。此外,ERα基因多态性可作为遗传易感背景影响PBC患者体内T细胞亚群的偏移及其相关细胞因子的表达。结论:雌激素α受体基因的多样性表达Th1、Th2类细胞因子的含量不同,Th1类细胞因子介导了对肝脏细胞的破坏作用,而Th2型细胞因子则具有一定的保护性作用。雌激素α受体基因中的Pp基因是肝硬化发病的易感基因,同时,雌激素受体基因的多态性会增加肝硬化发生的概率,也会影响PBC患者体内T细胞亚群的偏移及其相关细胞因子的表达。

重组yEGFP发光酵母细胞检测牛尿中雌激素类药物

用重组人雌激素受体(hER)基因酵母细胞(W303-1A/hER-ERE-yEGFP),分别对成年奶牛和犊牛尿样的雌激素药物残留进行检测测定。该重组酵母细胞是一种发光酵母细胞,其发光度与雌激素化合物具有剂量效应关系。结果显示,成年奶牛尿样中的雌激素类化合物高于犊牛尿样,分别为1.000×10-4和2.518×10-5雌二醇当量,但经统计分析无显著差异(P>0.05)。本研究所建立的方法高效、快速、高通量,可用于牛尿样中雌激素类药物残留分析。