重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白注射液治疗e抗原阳性慢性乙型肝炎的安全性及疗效初探

目的探讨重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白注射液治疗e抗原阳性慢性乙型肝炎的安全性及初步疗效观察。方法符合入组条件的e抗原阳性慢性乙型肝炎受试者随机分为10μg连续给药、10μg隔日给药及20μg隔日给药3个组别,均为肌内注射。研究期间定期进行生命体征监测、心电图及实验室安全指标以及HBV DNA和乙肝5项等疗效指标检查,评价其安全性及初步疗效。结果 3组不良事件的发生率分别为第1组100.00%(44例次/8例)、第2组83.33%(17例次/5例)、第3组100.00%(82例次/10例),其中判定与药物相关的均为干扰素应用后常见的不良反应,大部分未采取措施自行缓解,或经对症支持治疗后恢复/缓解。仅1例受试者因不良事件而导致脱落。治疗结束时3组受试者血清HBV DNA水平下降≥2log10的比例分别为:14.29%、0和30.00%,ALT复常率分别为14.29%、33.33%和20.00%。没有出现e抗原的阴转。结论不同剂量(10、20μg)重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白注射液连续肌内注射治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者,其耐受性和安全性良好,在短时间内可以降低HBV DNA载量及促进ALT复常,而且疗效与剂量呈正相关。

重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白注射液治疗慢性乙型肝炎受试者后血清中和抗体检测

目的考察受试者接受重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白治疗后的中和抗体产生情况。方法采用细胞病变效应法检测抗药抗体阳性血清的中和抗体活性。结果抗药抗体阳性血清的中和抗体活性检出率为0%。结论重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白治疗后受试者中和抗体产生率低。

注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺的建立及效果验证

旨在建立注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺,并进行效果验证。膜过滤工艺去除病毒验证结果表明,膜过滤后的蛋白质回收率在98%以上,分子排阻色谱纯度在膜过滤前后没有明显变化;经测试,膜过滤后小鼠白血病病毒、小鼠微小病毒、呼肠孤病毒滴度的降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。低pH值孵放灭活病毒验证工艺结果表明,低pH值孵放前后蛋白质含量、分子排阻色谱纯度没有明显变化;测试结果表明,室温处理时间≥0.5 h,小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒的滴度降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。该去除/灭活效果均符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求,建立的工艺有效保证了产品的质量及安全性。

高效抗反转录病毒治疗(HAART)对艾滋病患者血清炎性标志物水平影响研究

目的观察艾滋病患者高效抗反转录病毒治疗(HAART)对其血清炎性标志物(TNF-α、Ang-Ⅱ、hs-CRP)水平影响,并与正常人水平比较。方法监测36例HIV/AIDS患者(观察组)接受高效抗反转录病毒治疗(HAART)前和治疗后(6、12个月)的血清高敏C反应蛋白(high sensitive C-reactive protein,hs-CRP)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、血管紧张素-Ⅱ(angiotensinⅡ,Ang-Ⅱ)水平,并与36例健康体检者(对照组)相应血清炎性标志物比较。以流式细胞计数法检测CD4+T细胞数、CD4+T/CD8+T值。结果 AIDS接受HAART组治疗前、治疗后6、12个月及正常人静脉hs-CRP、TNF-α、Ang-Ⅱ水平分别为7.37±1.55ml/L,0.75±0.24ng/L,97.2±7.6pg/L、4.65±1.48ml/L,0.48±0.20ng/L,90.0±8.2pg/L、3.82±1.45ml/L,0.40±0.16ng/L,87.2±7.4pg/L和2.68±1.08ml/L,0.32±0.16ng/L,64.2±10.5pg/L。与治疗前比较,治疗6、12个月后的hs-CRP、TNF-α、Ang-Ⅱ水平均有明显降低(P均<0.05);CD4+T细胞数、CD4+T/CD8+T比值升高。结论高效抗反转录病毒治疗可以降低艾滋病患者血清hs-CRP、TNF-α、Ang-Ⅱ等炎性指标水平,提高机体免疫系统功能,控制艾滋病疾病发展。

HPLC测定重组Exendin-4-FC融合蛋白注射液中抗氧剂及其降解物

目的 建立HPLC对重组Exendin-4-FC融合蛋白注射液中11种抗氧剂及其降解物含量测定方法。方法 采用饱和硫酸铵沉淀蛋白,离心后上清液转移至经甲醇活化后的C_(18)固相萃取小柱中,分别用4 mL甲醇、5 mL乙酸乙酯依次洗脱小柱,洗脱液用甲醇-乙酸乙酯(2∶3)混合溶剂定容后过0.22μm PTFE疏水滤膜,经HPLC分析,外标法定量。色谱条件:Kinetex■ XB-C_(18) 100A(100 mm×4.6 mm,2.6μm)色谱柱,检测波长230 nm,柱温箱30℃,进样量5μL,流速0.4 mL·min^(–1),流动相0.1%甲酸-甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B),运行时间45 min。结果 11种目标物在2.5~35μg·mL^(–1)内线性关系良好(R~2≥0.99)。在25,10,5μg·mL^(–1) 3个浓度水平下,平均加样回收率为88.1%~106.5%,RSD为0.10%~9.05%。6份样品重复性RSD为2.01%~4.77%,12份样品中间精密度RSD为2.58%~9.75%,对3批次重组Exendin-4-FC融合蛋白注射液的0月,25℃加速3月及6月正/倒置样品进行检测,结果显示所有批次样品在不同检测点均未有抗氧剂及其降解物浸出。结论 该方法专属性好、准确度与精密度高、溶液稳定性好、方法耐用性高,能够用于对药品中抗氧剂类物质的含量检测。

表达CRT/E7融合蛋白的人乳头瘤病毒DNA疫苗对肿瘤生长和血管生成抑制作用的研究

研究HPV6bE7／CRTDNA疫苗免疫保护，清除已有感染和相关肿瘤细胞及其血管生成抑制作用，分析CRT抗血管生成的功能片段，为筛选高效的HPV疫苗提供实验依据。用重组质粒pcDNA3．1（＋）GFP—CRT120／HPV6bE7、pcDNA3．1（＋）-GFP—HPV6bE7、pcDNA3．1（＋）GFP—CRT120、pcDNA3．1（＋）-GFP—CRT180／HPV6bE7、pcDNA3．1（＋）-GFPCRT180通过肌内注射途径免疫C57BL／6小鼠。Matrigel法进行抗血管活性检测；B16／HPV6bE7细胞接种于C57BL／6雌性小鼠建立荷瘤模型，观察各组DNA疫苗对HPV6bE7基因的荷瘤组织的出瘤时间和肿瘤大小的影响。结果显示：重组DNA疫苗pcDNA3．1-CRT180／HPV6bE7和pcDNA3．1CRT180在动物体内能对bFGF诱导的新生血管的生成有明显的抑制作用；CRT180／HPV6bE7和CRT180能显著抑制荷瘤的大小且CRT180／HPV6bE7免疫组较其他组能明显延缓荷瘤的形成时间、生长速率以及肿瘤重量。CRT180／HPV6bE7免疫组较其他组能诱导更强的血管抑制作用和部分抑制肿瘤生长，推测抑制血管的功能片段存在于CRT120～180aa片段上。

抗重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白抗药抗体ELISA检测方法的建立及应用

目的:建立受试者血清中重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白抗药抗体的检测方法,考察用药后不同组别受试者的抗药抗体产生情况。方法:首先建立了检测血清中抗药抗体ELISA方法并进行了方法学的验证;然后筛选了3个给药组血清样本中的抗药抗体,用结果为阳性的受试者血清最大稀释倍数表示抗药抗体的滴度。结果:该ELISA方法检测乐复能血清抗药抗体的特异性好,检测限为204 ng·mL-1,高、中、低及阴性样本批内、批间重复性CV值均小于6%,达到常规ELISA的标准。10μg连续给药组7例受试者首次用药3周后有3例产生抗体,用药5周后均产生抗体;10μg隔日给药组6例受试者首次用药4周后均产生抗体;20μg隔日连续给药组10例受试者首次用药2周后有1例产生抗体,用药4周后8例产生抗体,用药6周后9例产生抗体。结论:建立了重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白免疫原性的ELISA检测方法。首次用药4周后3个组的抗药抗体阳性率达到高值,组别之间无明显差别。比较而言,第3组(20μg隔日给药)的抗药抗体滴度较低。

重组人内皮抑素腺病毒抗肿瘤实验研究

目的肿瘤生长具有血管依赖性。内皮抑素为胶原X羧基末端裂解片段,是重要的内源性血管抑制因子。实验中利用重组人内皮抑素腺病毒(recombinanthumanendostatinadenorirus,Ad-hEndo)在肿瘤局部给药以探索其抗血管基因治疗的可行性。方法以Ad-hEndo感染体外培养肿瘤细胞,观察重组蛋白表达及其对培养的血管内皮细胞的抑制效应;在裸鼠A549肺癌模型中瘤内注射重组病毒,观察肿瘤抑制效应、剂量依从效应和毒副反应。结果不同感染复数的Ad-hEndo感染肿瘤细胞均表达重组内皮抑素蛋白,并能抑制血管内皮细胞的生长。动物实验中Ad-hEndo治疗组肿瘤体积及肺转移结节数明显低于对照组,且转移数与治疗剂量负相关。结论以腺病毒为载体的肿瘤局部血管基因治疗能抑制肿瘤新生血管形成进而有效抑制肿瘤生长和转移,其效应具有剂量依从性。

表达人CD137配体重组腺病毒的构建及其抗肿瘤免疫作用的研究

目的构建并制备表达人CD137L蛋白的5型重组腺病毒(Ad5-CD137L),并初步研究其在小鼠中的抗肿瘤免疫效果。方法将密码子优化CD137L蛋白的表达基因插入pDC316穿梭质粒,并与pBH-GloxΔE1,3Cre腺病毒骨架质粒,共同转染HEK293细胞,构建Ad5-CD137L种子。扩增并纯化后,对所得Ad5-CD137L重组腺病毒的插入目的基因与蛋白表达情况进行鉴定。检测Ad5-CD137L在C57BL/6小鼠体内的特异性细胞免疫和抗肿瘤免疫水平。结果成功地构建了Ad5-CD137L,PCR和测序结果表明插入目的基因与构建理论值相符。免疫荧光法鉴定Ad5-CD137L能在HEK293细胞中表达目的蛋白,经Western印迹法鉴定该目的蛋白的相对分子质量约为25 000,与理论值相符。与空腺病毒相比,Ad5-CD137L能显著诱导小鼠特异性IFN-γ(t=6.315,P=0.003),抗肿瘤免疫效果更显著(t21 d=8.275,t29 d=4.492;t39 d=5.101,P均<0.001)。结论成功构建了Ad5-CD137L,该重组病毒具有特异性细胞免疫原性和抗肿瘤免疫效果。

高效抗反转录病毒治疗对艾滋病患者血清TNF-α、Ang-Ⅱ、hs-CRP水平的影响

目的针对艾滋病患者的病症,探讨艾滋病患者高效抗反转录病毒治疗(HAART)对患者的血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、血管紧张素(Ang-Ⅱ)、血清高敏C反应蛋白(hs-CRP)水平的影响。方法通过选取于2016年1—12月期间在孝感市中医医院治疗的40例艾滋病患者作为观察组,同时选取40例检测正常者为对照组。观察组患者施以HAART,对比检测观察组患者在治疗前及治疗后的半年及1年hs-CRP、TNF-α、Ang-Ⅱ水平。使用流式细胞计数法对CD4+T细胞数、CD4+T/CD8进行对比。结果观察组接受HAART前,hsCRP、TNF-α、Ang-Ⅱ水平高于对照组,CD4+T细胞数、CD4+T/CD8低于对照组(均P<0.05);治疗半年和1年后,观察组hs-CRP、TNF-α、Ang-Ⅱ水平较治疗前明显降低,CD4+T细胞数、CD4+T/CD8明显上升(均P<0.05)。结论通过对艾滋病患者施以HAART,能够有效的降低艾滋病患者的血清TNF-α、Ang-Ⅱ、hs-CRP水平,在一定程度上提升患者的自身机体免疫能力。

外周血炎症因子和T淋巴细胞激活在抗人类免疫缺陷病毒感染治疗中的变化

目的探索人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染/艾滋病患者外周血炎症因子和T淋巴细胞激活在抗HIV治疗中的变化。方法选取2017年1月至2019年12月在长沙中南大学湘雅二医院感染科门诊接受抗反转录病毒治疗(anti-retroviral therapy,ART)的HIV感染/艾滋病患者共206例,为HIV感染组,定期随访并收集治疗前,治疗后6、12、24个月的血液标本;另选取同期进行体格检查者52名,为健康对照组,留取血液标本。采用酶联免疫吸附试验检测血浆白细胞介素(interleukin,IL)-6、超敏C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α。以流式细胞术检测外周血CD3+CD4^(+)T淋巴细胞计数、外周血单个核细胞中CD4^(+)CD38^(+)和CD8^(+)CD38^(+)T淋巴细胞百分比。采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测血浆HIV RNA载量。统计学方法采用配对t检验和皮尔逊相关分析。结果HIV感染组治疗前血浆IL-6、超敏CRP和TNF-α分别为(13.42±2.35)pg/mL、(4012.46±1012.35)μg/L和(51.78±11.32)μg/L,分别高于健康对照组的(6.14±0.78)pg/mL、(707.21±305.76)μg/L和(19.01±6.48)μg/L,差异均有统计学意义(t=12.56、16.79、13.45,均P<0.001);启动ART后,HIV感染组IL-6、超敏CRP和TNF-α水平均逐渐下降,治疗后24个月恢复正常。HIV感染组治疗前CD3+CD4^(+)T淋巴细胞计数为(256.00±65.32)/μL,HIV RNA载量为(4.467±4.244)lg拷贝/mL,两者呈负相关(r=-0.625,P=0.041)。HIV感染组治疗前,治疗后12、24个月的CD8^(+)CD38^(+)T淋巴细胞百分比均高于健康对照组,差异均有统计学意义(t=3.85、6.84、2.57,均P<0.050);治疗前CD8^(+)CD38^(+)T淋巴细胞百分比与HIV RNA载量呈正相关(r=0.768,P=0.026)。HIV感染组治疗前,治疗后12、24个月的CD4^(+)CD38^(+)T淋巴细胞百分比均低于健康对照组,差异均有统计学意义(t=6.80、1.10、2.11,均P<0.050)。结论HIV感染可致机体免疫功能受损,同时导致异常免疫激活,但随着ART的持续可逐渐好转。

镭普克的制备及对小鼠H22肝癌的抑制作用

报道重组别藻蓝蛋白(rAPC，镭普克)表达菌株的20L高密度发酵、镭普克制备及对小鼠H22肝癌抑制作用的实验结果。采用两步发酵法最终OD600为36．18，比一步发酵法的40．16值低，但镭普克表达率是后者的1．8倍，为30．24％，镭普克生物量提高1．62倍。亲合层析结合分子筛层析纯化后，镭普克纯度可达98．03％。对小鼠H22肝癌静脉注射剂量为50mg/kg／d，抑瘤率为62．2％。初步的免疫实验结果表明，镭普克对淋巴B细胞功能具有增强作用。结果提示镭普克大规模生产的潜力和临床应用的可能性。

世界第一个基因治疗药物在我国获准正式上市

拥有自主知识产权的重组人p53腺病毒注射液已于2004年1月20日获得国家食品药品监督管理局的准字号生产批文，从而标志着我国也是世界上第一个获得国家批准的基因治疗药物业已正式上市。

猪圆环病毒2型cap基因与猪γ-干扰素基因双表达载体的构建及稳定表达

通过PCR方法分别从含有猪圆环病毒2型(PCV-2)核衣壳蛋白(Cap)基因和猪,γ-干扰素(PoIFN-γ)基因的重组克隆载体pMD18-PCV-2Cap和pMD18-PoIFN-γ中扩增出Cap和PoIFN-γ的基因,将两基因亚克隆到真核表达载体pBudCE4.1中,构建重组真核双表达载体pBud-IFNPCV。重组质粒转染BHK-21细胞后进行Zeocin^(TM)抗性筛选建立细胞系,阳性细胞通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测cap和PoIFN-γ在BHK-21细胞中的表达。结果显示,试验中筛选出1株Zeocin^(TM)抗性阳性BHK-21细胞,cap和PoIFN-γ均在该细胞中获得稳定高效表达,这将为猪圆环病毒病的防治提供新的方法。

腺病毒介导的SPINK6表达在肝癌细胞QGY-7703中功能的初步研究

为了探讨SPINK6对肝癌细胞的抑制作用,使用缺陷型腺病毒载体构建载有SPINK6基因的重组腺病毒,感染肝脏肿瘤细胞QGY-7703,上调SPINK6蛋白的表达.通过CCK8细胞增殖实验和软琼脂克隆形成实验证实SPINK6对QGY-7703细胞生长的抑制,通过Transwell实验和细胞划痕试验证实SPINK6对QGY-7703细胞的体外细胞迁移与侵袭能力的抑制,为我们进一步揭示SPINK6的作用机制奠定了基础.