重组鱼腥藻脂肪氧合酶基因的克隆表达、分离纯化及活性分析

克隆鱼腥藻PCC7120基因组中脂肪氧合酶(ana-LOX)基因,对该功能基因进行了定点突变研究,确定了ana-LOX的最短功能基因长度,构建原核重组表达载体,对重组ana-LOX进行了分离纯化和性质研究。从GenBank中搜索到鱼腥藻PCC7120基因组中含有LOX基因,通过序列分析和比对,发现LOX功能基因位于双功能酶AOS(单加氧酶)-LOX的C端,通过定点突变研究,证实了ana-LOX活性中心位点为His197、His202、His369、Asn373和Ile455。通过逐步缩短基因长度的策略,获得ana-LOX基因的最短功能基因长度为1 254 bp。构建的表达载体pET-32a/ana-LOX转化入BL21(DE3)宿主内,在低温16℃条件下的诱导表达,重组脂肪氧合酶活力可达6 750 U/mL。表达产物通过Ni-NTA亲和柱进行分离纯化,比活达到11.4×104U/mg蛋白,酶活回收率为60.89%。重组ana-LOX最适反应温度45℃,最适反应pH 6.0,在常温下具有较好的稳定性,金属离子Fe2+、Mg2+、Ca2+对该酶存在明显的激活作用,而Fe3+和Cu2+对该酶有强烈的抑制作用。重组ana-LOX能够改善面团的显微结构。该研究获得了高效表达重组ana-LOX,为实现其在食品加工中的应用提供了参考。

重组脂肪氧合酶对面团流变性质及面包品质的影响

通过测定酶促作用前后面筋蛋白(wheat gluten,WG)的自由巯基含量、表面疏水性、黏弹性等的变化,研究了重组脂肪氧合酶(p ET-32a-ana-lipoxygenase,ana-r LOX)对水溶性阿拉伯木聚糖(water-soluble arabinoxylan,WEAX)和WG相互作用的影响,并探讨了ana-r LOX对面包品质改良的作用。结果表明,与添加WEAX的样品相比,加入ana-r LOX和WEAX后WG的自由巯基含量下降了21%,表面疏水性指数增大,流体动力学半径增大了27.3%,WG的黏弹性明显增加;面包的硬度、胶着性、咀嚼性降低,回复性增强,明显改善了面包品质。

大鼠5-脂肪氧合酶cDNA的重组腺病毒制备及在大鼠血管外膜成纤维细胞中的表达

目的利用细菌内同源重组法快速构建携带大鼠5-脂肪氧合酶(5-lipoxygenase,5-LO)cDNA的重组腺病毒质粒和制备表达大鼠5-LO的重组腺病毒,并在大鼠原代血管外膜成纤维细胞中实现过表达。方法聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增大鼠5-LOcDNA片段,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,构建成转移质粒pshuttle-CMV-5LO;用PmeI线性化的pshuttle-CMV-5LO转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183,通过同源重组获得阳性重组质粒pAdEasy-1-5LO。重组质粒经鉴定后用Pad酶切,转入HEK293细胞,包装成重组腺病毒Ad-1-5LO,经纯化,鉴定,滴度测定,转染体外培养的大鼠原代血管外膜成纤维细胞,Western blot检测腺病毒载体在体外的过表达。结果 5-LOcDNA成功地插入到穿梭质粒中,pshuttle-CMV-5LO与pAdEasy-1在BJ5183中成功发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-1-5LO,重组腺病毒经PCR和酶切鉴定表明携带有目的基因5-LOcDNA,滴度约为1.0×10^(15)pfu/L,转染大鼠原代血管外膜成纤维细胞后经Western blot检测,细胞内5-LO的表达明显增加。结论细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,制备出的高滴度重组腺病毒Ad-1-5LO实现了在血管外膜成纤维细胞中的过表达,为研究5-LO途径在血管重构中的作用奠定了基础。

重组大肠杆菌生产脂肪氧合酶的发酵优化

以本研究室保存的脂肪氧合酶生产菌株重组大肠杆菌Rosetta(DE3)/pre-LOX为研究对象,在摇瓶水平上对培养基、诱导温度、诱导剂浓度、外源添加物进行优化;在3L发酵罐水平上对初始诱导菌体浓度(OD600)进行优化。摇瓶发酵条件下,诱导温度为20℃,当菌体OD600达到0.6,添加1mmol/L诱导剂及0.5%吐温-20,胞外酶活达到8.4U/mL;在3L发酵罐上,诱导温度为20℃,当菌体OD600达到8.0,添加1mmol/L诱导剂及0.5%十二烷基磺酸钠,胞外酶活为8.3U/mL,这是国内外发酵生产脂肪氧合酶的最高水平,对生产实践具有一定的指导意义。

重组脂肪氧合酶分子改造

脂肪氧合酶（Lipoxygenase,EC1.13.11.12,LOX）是一种双加氧酶,它能够专一催化多元不饱和脂肪酸中的cis,cis-1,4-戊二烯结构,通过分子加氢形成具有共轭双键的氢过氧化物。LOX在食品、医药和化工等领域都有广泛的应用,市场需求巨大。但微生物来源的LOX往往具有热稳定性较差的缺点,这限制了LOX在工业加工中的应用,因此提高酶的热稳定性对提高酶的应用价值和降低工业成本具有重要意义。在脂肪氧合酶N端与C端结构域链接处的loop结构（L6）分别插入1～3个L6序列,构建突变体L6 Ⅰ、L6 Ⅱ、L6 Ⅲ。3种突变体均可以在大肠杆菌中正常分泌表达,突变体的二级结构和三级结构与野生酶没有明显差异。L6 Ⅰ、L6 Ⅱ、L6 Ⅲ 3个突变体在50℃下的热稳定性分别是野生酶的2.3倍、3.2倍和4倍,其中突变体L6 Ⅱ、L6 Ⅲ的最适反应温度比野生酶提高了5、10℃。突变体的比酶活分别降低为野生酶的28.7%、57.9%和47.6%,同时其疏水性比野生酶提高了约300%。

鱼腥草中抑制环氧合酶的活性成分

鱼腥草 Houttuynia cordata Thunb.的地上部分用作传统中药,可清热解毒、消炎,尤其用于呼吸道疾病和皮肤病。曾报道从中分离出黄酮、脂肪酸、挥发油、苯甲酰胺、马兜铃酸类、4,5-二氧阿朴菲生物碱及吡啶衍生物。近年有报道鱼腥草蒸汽蒸馏液具有杀病毒作用。