重组鸡痘病毒首免与灭活疫苗加强免疫对高致病性禽流感免疫效果的影响

用表达H5亚型禽流感病毒(AIV)HA与NA基因的重组鸡痘病毒(rFPV)rFPV-12LSH5NA对10日龄带有H5亚型AIV母源抗体的商品鸡进行了首次免疫,17日龄时再用H5亚型AIV全病毒灭活疫苗加强免疫。免疫鸡分为2个批次,分别在24和31日龄用H5亚型AIV进行致死性攻击。在24日龄攻毒组中,rFPV首免与全病毒灭活疫苗加强免疫组的死亡比例(0/17)显著低于17日龄全病毒灭活疫苗单独免疫组(16/17)。在31日龄攻毒组中,rFPV首免与全病毒灭活疫苗加强免疫组的死亡比例(0/17)显著低于10日龄rFPV单独免疫组(6/17)。结果显示,在鸡群普遍存在针对H5亚型AIV母源抗体的情况下,rFPV首免与全病毒灭活疫苗配合使用能使鸡体快速建立坚强的免疫保护反应,是一种非常有效的免疫策略。

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗系以高度成熟安全的鸡痘病毒为载体研制的新型基因工程禽流感一鸡痘二联疫苗，该疫苗毒株的研制是采用重组DNA技术，将我国H5N1亚型禽流感病毒早期分离株的HA和NA基因同源重组到鸡痘病毒疫苗株的基因组中，构建重组鸡痘病毒(rFPV—HA—NA)，经体外、体内试验表明该重组鸡痘病毒具有良好的免疫原性。同时经细胞连续传代，证实了重组鸡痘病毒具有良好的遗传稳定性，从而进一步保证了该疫苗的免疫原性。

禽用重组鸡痘病毒活载体疫苗研究及其应用

1鸡痘病毒的特点、活载体的构建及作为活载体的优越性 1.1重组鸡痘病毒的特点及活载体的构建 鸡痘病毒(Fowlpox Virus,FPV)属于痘病毒科禽痘病毒属,含很大的双链DNA分子约300kb,其中存在许多病毒本身复制的非必需区(nonessential region,NER),并预计可容纳远不止25kb的外源基因.……

鸡痘病毒282E_4株TK基因重组载体质粒的构建

应用已克隆的鸡痘病毒（ＦＰＶ）２８２Ｅ＿４株基因组ＴＫ基因，在ＮｃｏⅠ部位引入痘苗病毒Ｐ７．５启动子和Ｐ１１启动子控制下的大肠杆菌ＬａｃＺ基因，经酶切鉴定，成功地构建了用于ＦＰＶ重组的载体质粒。与亲本毒株在鸡胚成纤维细胞内共转染，产生了表达ＬａｃＺ基因的重组鸡痘病毒。经传代筛选、纯化，重组病毒较稳定。实验结果表明，以ＴＫ基因构建的重组载体质粒可用于外源基因的重组表达研究。

表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因重组鸡痘病毒转移载体的构建

根据文献设计2对引物,PCR扩增FPV复制非必需区中外源基因插入位点两侧翼的片段,分别克隆到pUC19和pSK质粒中,并命名为pFP1和pFP2。根据文献设计引物,PCR扩增鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的GB基因的编码区。将GB基因克隆到质粒pFP1中获得重组质粒pFP1-GB;用酶切质粒pEGFP,得到GFP片段并克隆到质粒pFP2中,得到重组质粒pFP2-GFP。双酶切pFP1-GB得到FP1-GB片段,并克隆到质粒pFP2-GFP中,得到重组质粒pFP1GB-FP2GPF。酶切质粒pE/L-7.5,获得背向连接的2个鸡痘病毒启动子片段——PE/L-7.5,并将该片段克隆到重组质粒pFP1GB-FP2GPF获得重组质粒pGB-GFP,该质粒即为鸡痘病毒的转移质粒。在质粒pGB-GFP中,2个背向连接的启动子被克隆到的GB和GFP基因之间,分别启动GB和GFP基因的表达。经酶切和测序鉴定pGB-GFP,启动子PE/L和P7.5已分别正确地插入到GB和GFP基因之间,分别启动外源表达基因GB和筛选标记基因GFP的表达,从而证明已获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因重组鸡痘病毒转移载体pGB-GFP。该载体为下一步获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因的重组鸡痘病毒奠定基础。

表达非洲猪瘟病毒p72蛋白重组猪痘病毒的构建及鉴定

【目的】旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组猪痘病毒,为探索猪痘病毒(SPV)作为非洲猪瘟新型活疫苗载体的可行性。【方法】本研究优化合成非洲猪瘟病毒B646L基因,克隆至重组猪痘病毒通用转移载体pUSG11/P28,构建重组转移质粒pUSG11/P28-B646L,经脂质体介导转染预先感染猪痘病毒的PK15细胞,出现病变后通过绿色荧光标记筛选和纯化重组病毒。拯救的重组病毒经PCR和基因测序鉴定后,通过Western blotting和间接免疫荧光试验检测p72蛋白的表达情况,并测定重组病毒的增殖特性和遗传稳定性。【结果】重组转移质粒pUSG11/P28-B646L在PK15细胞内和SPV成功进行了同源重组,纯化得到的重组病毒含有B646L基因,且基因序列正确。Western blotting和间接免疫荧光试验结果表明,重组病毒rSPV-B646L在PK15细胞中能表达非洲猪瘟病毒p72蛋白,表达的蛋白大小正确,且能与p72单克隆抗体发生特异性反应。一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性没有明显差异。重组病毒在PK15细胞上连续传15代后,插入的外源基因没有发生突变或缺失。【结论】研究以SPV为载体,成功构建了正确表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组猪痘病毒,重组病毒在PK15细胞中有良好的遗传稳定性,B646L基因的插入没有影响重组病毒在PK15细胞上的增殖能力,表达的p72蛋白具有反应原性。研究成果为非洲猪瘟多基因重组猪痘病毒载体疫苗的研发提供依据。

鸡痘病毒载体启动子的优化

要提高外源基因在鸡痘病毒 (FPV)载体的表达量 ,必须使用强启动子来控制表达。为构建较强的启动子组合 ,根据痘苗病毒天然启动子P7 5的结构 ,人工合成 4条寡核苷酸 ,形成一个早期启动子和一个晚期启动子 ,其首尾可相互连接。利用分子生物学常用实验方法把合成的启动子进行不同组合 ,最终形成 10个较有代表性的启动子组合PS1～ 10。在其下游插入大肠杆菌 β 半乳糖苷酶基因LacZ ,并进一步构建成鸡痘病毒转移载体 pFBS1～10 ,同时以P7 5作对照构建成 pFB7 5。以脂质体介导转染鸡痘病毒中国疫苗株 2 82E4感染 3h～ 4h后的原代鸡胚成纤维细胞 (CEF)单层。用蓝斑筛选法纯化病毒 4次 ,最终得到稳定的重组病毒。将纯化的重组病毒感染次代CEF ,分别于感染后 10h、2 4h、36h、48h、72h收获细胞 ,制备提取物 ,检测提取物中 β 半乳糖苷酶的活性。通过计算比较 ,筛选出其中较强的启动子组合LLEE ,其表达活性约为P7 5的 3 5倍 ,为进一步构建高效表达的鸡痘病毒通用载体打下了良好的基础。

口蹄疫重组鸡痘病毒诱导猪特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性检测

目的:评价口蹄疫重组鸡痘病毒vUTAL3CP1诱导猪产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性的能力。方法:用PCR方法亚克隆O型FMDVVP1基因C末端部分片段(第1 30～2 1 3AA)。将其插入真核表达载体pDisplay中,构建质粒pDisplay- mVP1。将pDisplay -mVP1转染PK 1 5细胞,经3次G41 8加压筛选,并用RT- PCR和IFA鉴定,证明获得表达目的基因的PK 1 5 /pDisplay- mVP1细胞。最后,利用该细胞作为靶细胞,用LDH法检测口蹄疫重组鸡痘病毒vUTAL3CP1免疫猪的特异性CTL杀伤活性。结果:vUTAL3CP1免疫组在效靶比2 5∶1和5 0∶1时,CTL裂解活性分别达到42 . 84%±3 2. 1 %和61 . 94%±4 2. 8% ,显著高于灭活疫苗组与其它对照组(p <0 . 0 1 )。结论:vUTAL3CP1可以诱导猪产生高水平的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性,为进一步的FMDV基因工程疫苗的研究奠定了基础。

HIV-2 Gp105基因重组鸡痘病毒的构建及鉴定

目的 研制预防HIV -2的重组鸡痘病毒活载体疫苗。方法 将HIV -2Gp10 5基因插入鸡痘病毒转移载体pUTA2复合启动子的下游 ,构建鸡痘病毒转移载体pUTA2 Gp10 5。将该重组质粒与鸡痘病毒 (FPV) 2 82E4株共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,进行同源重组。通过 3次BrdU加压筛选 ,以PCR、RT PCR、IFA和Westernblot鉴定重组病毒。结果 从重组鸡痘病毒的基因组和总RNA中能扩增出大小为 6 5 3bp的目的基因 ;感染重组病毒的CEF细胞与特异性荧光抗体发生阳性反应 ;表达产物与人HIV- 2血清发生阳性反应 ,目的蛋白相对分子质量约为10 5 0 0 0。结论 成功获得 1株重组鸡痘病毒 ,可正确表达HIV 2Gp10 5基因。

鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗

鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗是由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所与哈尔滨维科生物技术公司经过多年的课题攻关，研制而成的世界上第一个传染性喉气管炎的活载体疫苗，该疫苗目前已经获得农业部颁发的新兽药(二类)证书(农业部公告第461号)，是世界上第一个达到国际疫苗应用标准，并且完全拥有自主知识产权的禽痘病毒活载体疫苗。

禽流感疫苗获突破鸡免疫保护期更长

在农业部和科技部共同主持下，具有国际先进水平的新型高效的重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型)和禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗。由农业部动物流感重点开放实验室研制成功。该两种疫苗近日通过农业部兽药审评委员会评审．获得农业部新兽药证书。

鸡传染性法氏囊病疫苗的研究进展

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(In⁃fectious Bursal Disease Virus,IBDV)引起的、主要侵害幼龄鸡的一种急性、高度接触性传染病,其主要特征是导致法氏囊的严重损伤和免疫抑制。自20世纪80年代以来,IBDV在很多国家和地区均发现以毒力增强为主要特征的抗原变异,出现了变异毒株(vIBDV)和超强毒株(vvIB⁃DV)。IBD在全球范围内给养禽业造成了重大的经济损失。目前主要采取疫苗接种和生物安全相结合的综合防控措施,该文对已商品化的和正在研发中的IBD减毒活疫苗、全病毒灭活疫苗、免疫复合物疫苗、重组载体活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗等进行综述,以期为更好的防控IBD提供理论参考。

鸡传染性喉气管炎疫苗研究进展

鸡传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis,ILT)是由喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus,ILTV)引起的鸡的一种病毒性呼吸道传染病。ILT是一种较为严重的禽病毒病;根据ILT的临床表现分为急性型和温和型,急性型发病率和死亡率均较高,温和型死亡率低但在养殖密集地区感染逐渐增多。ILT可引起家禽死亡和蛋鸡产蛋率下降,给养禽业带来严重的经济损失。目前,通过使用疫苗接种和生物安全相结合的综合防控措施,在集约化养禽地区ILT已得到较好的控制。该文对多个国家已商品化的ILT减毒活疫苗和重组病毒载体活疫苗,以及正在研发中的ILT重组病毒载体活疫苗、基因缺失活疫苗、病毒样颗粒疫苗等新型ILT疫苗进行综述,以期为更好地防控ILT提供理论参考。

我国禽流感疫苗大突破鸡的免疫保护期更长

在农业部和科技部共同主持下．具有国际先进水平的新型高效的重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N亚型）和禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗．由农业部动物流感重点开放实验室研制成功。

鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗

本课题的研究起始于1996年，得到“九五”国家高技术研究发展计划（863计划）课题（课题名称：鸡传染性喉气管炎、马立克氏病和新城疫二价、三价基因工程疫苗的研究）的支持（1996～2000年）。后来，该成果又得到了“十五”国家863计划课题（课题名称：鸡痘病毒载体多价基因工程疫苗及禽流感等亚单位疫苗的研制）的支持（2001～2005年）和农业科技成果转化资金项目课题（课题名称：传染性喉气管炎重组鸡痘病毒二价疫苗）（2001年～2003年）的资助。

我国成功研制新禽流感疫苗 切断病毒传播链

国家禽流感参考实验室主任陈化兰25日表示，由这个实验室负责研制的H5N1亚型重组禽流感病毒灭活疫苗、H5亚型禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗已经取得成功。新型疫苗能够彻底切断高致病性禽流感——H5N1亚型禽流感病毒通过水禽向家禽、哺乳动物和人类传播的传播链。