表达禽流感病毒H5亚型基因重组鸭瘟病毒的构建

为了应用和发展鸭肠炎病毒(DEV)载体疫苗,基于细菌人工染色体(BAC)人工合成带有p MCMV IE启动子和HA基因序列的表达盒,将其插入到UL55和LORF11之间的非编码区,从而构建出DEV载体疫苗。RFLP分析结果显示DEV BAC及其突变体条带与预期结果存在轻微的差异,将BAC及其突变体拯救后发现其生长性能与亲本病毒没有显著差异。间接免疫荧光和Western blot结果显示,载体疫苗在感染鸡胚成纤维细胞(CEF)后大量表达了HA蛋白质。表明成功构建了能稳定表达禽流感病毒H5亚型基因重组鸭瘟病毒。

表达I型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒的构建

扩增鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因,并在其中间引入Bgl II酶切位点,再之克隆到pUC19载体,获得载体pTK。用限制性内切酶从已有质粒pcDNA-LacZ上切下CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒,插入到pTK的TK基因中,获得质粒pTCL。用质粒T-VP1做模板,扩增出I型鸭甲肝病毒(以前称为血清I型鸭肝炎病毒)VP1基因,克隆到质粒pTCL表达盒的多克隆位点KpnI与XbaI之间,构建含LacZ及VP1基因的转移载体质粒pT-CL-VP1。将此转移载体与鸭瘟病毒C-KCE毒株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达I型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒。

表达2.3.2.1d分支H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸭瘟病毒的构建和评价

为研究H5亚型禽流感病毒(AIV)HA基因重组鸭瘟病毒(DEV)载体活疫苗,本研究利用DEV疫苗株多片段体外拯救系统,将我国H5亚型AIV 2.3.2.1d分支代表病毒CK/LN/SD007株的血凝素(HA)基因插入DEV基因组中,构建了重组DEV,对其进行PCR、间接免疫荧光实验、western blot和传至15代后的遗传稳定性试验。结果显示,构建了一株表达CK/LN/SD007株HA基因的重组DEV,并且HA基因能够在重组病毒中正确表达并稳定遗传,命名为rDEV H5-12;将rDEV H5-12和亲本病毒DEV疫苗株接种鸡胚成纤维细胞(CEF)后,收集96 h内不同时间点的病毒样品,检测TCID50并绘制生长曲线。结果显示,rDEV H5-12在CEF中的生长曲线和亲本病毒DEV疫苗株无显著差异;rDEV H5-12以105 TCID50免疫SPF鸭2周后,进行DEV和AIV攻毒保护试验。结果显示,rDEV H5-12一次免疫SPF鸭后2周即能诱导对DEV强毒和AIV(CK/LN/SD007)攻击的完全保护,即免疫组SPF鸭在观察期内无排毒,无死亡,对照组SPF鸭在观察期内全部排毒,而且死亡;rDEV H5-12以105 TCID50免疫SPF鸭2次后,每周采集血清进行血凝抑制(HI)抗体效价检测。结果显示,rDEV H5-12首免SPF鸭后2周,多数鸭HI抗体转阳,加强免疫后1周,HI抗体水平达到高峰(HI抗体最高水平为25),随后HI抗体缓慢下降,至加强免疫后第7周,37.5%的鸭HI抗体仍为阳性。以上结果表明,拯救的表达H5亚型AIV HA基因的重组鸭瘟病毒(rDEV H5-12),可作为防控鸭瘟和水禽流感的二联活疫苗候选株。本研究为DE和水禽H5亚型AI的防控提供了新思路。

表达H5亚型禽流感病毒不同形式HA基因重组鸭瘟病毒的构建及HA表达形式的鉴定

为研究禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的信号肽以及跨膜区对HA蛋白在重组病毒中表达的影响,本研究以鸭瘟病毒(DEV)为载体,在DEV基因组的US7和US8基因之间通过同源重组插入去除信号肽或跨膜区的H5N1亚型AIV HA基因编码序列,分别构建了缺失信号肽HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PK)和缺失跨膜区HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PSM),并传至20代,经PCR对插入的外源基因编码序列扩增及序列测定,表明外源基因能够在重组病毒基因组中稳定存在;间接免疫荧光和western blot鉴定结果表明去除信号肽的HA蛋白能够在重组病毒感染的鸡胚成纤维细胞浆中正确表达,而去除跨膜区的HA蛋白能够在感染细胞的培养液中检测到。本研究为表达H5N1亚型AIV HA基因重组DEV载体弱毒疫苗在鸭体内免疫机制的进一步研究奠定基础。

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒的构建

利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因(约2.5kb),将其克隆入pUC19载体获得载体puDTK。根据已知载体pcDNA-LacZ的序列设计了一对引物,PCR扩增出pcDNA-LacZ上含CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒插入puDTK的TK上,获得质粒puDTCL。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因序列,设计引物从T-HA质粒上扩增出HA基因,克隆到puDTCL的表达盒的多克隆位点NheI与ApaI之间,成功构建含LacZ及HA基因的转移载体质粒puDTCL-HA。将这载体质粒与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达HA基因的重组鸭瘟病毒。

鸭瘟病毒疫苗株UL44.5和UL44基因间隔区作为复制非必需区的鉴定

为探寻鸭瘟病毒(DEV)基因组中适合外源基因插入的复制非必需区,本研究利用本实验室前期建立的DEV疫苗株多片段拯救系统,结合E/T克隆技术、LR克隆技术将含有红色荧光蛋白(RFP)表达框架的目的片段,定向插入到含DEV基因组复制非必需区的粘粒中,该位点位于DEV基因组UL区的UL44.5和UL44之间,拯救获得了重组病毒(rDEV)。通过PCR和荧光显微镜鉴定该重组病毒。结果显示,经PCR扩增,r DEV可以扩增到预期目的片段,观察可见红色荧光,表明RFP基因能够在重组病毒中稳定存在并正确表达;生长动力学结果显示,重组病毒在CEF中的增殖效率与DEV疫苗株无显著差异。将r DEV以105 TCID50的剂量免疫SPF鸭后,DEV攻毒保护试验结果显示,r DEV和亲本株DEV活疫苗对SPF鸭的保护效率均为100%。本研究筛选到DEV基因组中的一个可供外源基因插入的位点,为以DEV为载体构建相关重组疫苗研制提供依据。