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结核分枝杆菌重组Ag85A蛋白抗原诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究 被引量:2
1
作者 张灵霞 吴雪琼 +2 位作者 张俊仙 史迎昌 梁建琴 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 2002年第6期10-12,共3页
目的 :结核分枝杆菌重组Ag85A抗原诱发豚鼠迟发型超敏 (DTH)反应。Ag85A剂量、观察时间对DTH的影响。方法 :常规皮肤实验法 :灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠 ,皮肤试验以生理盐水为阴性对照 ,5IUPPD标准品为阳性对照 ,0 .1、0 .2、0 .4、0 .6... 目的 :结核分枝杆菌重组Ag85A抗原诱发豚鼠迟发型超敏 (DTH)反应。Ag85A剂量、观察时间对DTH的影响。方法 :常规皮肤实验法 :灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠 ,皮肤试验以生理盐水为阴性对照 ,5IUPPD标准品为阳性对照 ,0 .1、0 .2、0 .4、0 .6、0 .8及 1.0 μg重组抗原分别于背部皮内注射 ,注射后 2 4、4 8及 72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。皮肤试验轮圈法 :生理盐水、5IUPPD及 0 .4、0 .6、0 .8、1.0 μgAg85A抗原 ,以轮圈法注射于同一只豚鼠背部一侧 ,每批 6只 ,共 3批。于注射后 2 4、4 8、72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。结果 :常规皮肤试验 0 .1、0 .2 μg重组Ag85A抗原诱发DTH的平均直径与PPD相比有显著差异 (P <0 .0 5 ) ,而 0 .4、0 .6、0 .8、1.0重组Ag85A抗原诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比 ,无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,2 4h平均直径显著高于 4 8h平均直径 (P <0 .0 5 ) ,2 4h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后结果与常规皮肤试验结果一致。结论 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 重组ag85a蛋白抗原 DTH
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结核分枝杆菌抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6和Rv2031c-Rv2626c重组腺病毒的构建及鉴定 被引量:4
2
作者 王丽梅 姜泓 +1 位作者 康健 靳芊芊 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期191-195,共5页
目的构建表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6(AE)和Rv2031c-Rv2626c(R2)的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗的研究奠定基础。方法体外合成人延长因子1α(EF1α)启动子DNA序列,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,... 目的构建表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6(AE)和Rv2031c-Rv2626c(R2)的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗的研究奠定基础。方法体外合成人延长因子1α(EF1α)启动子DNA序列,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建含有CMV、EF1α双启动子的腺病毒穿梭载体。PCR扩增课题组前期构建的AE、R2融合蛋白基因,并依次亚克隆至上述腺病毒穿梭载体的CMV和EF1启动子下游,阳性重组穿梭质粒命名为pAd-AE-R2。将pAd-AE-R2与骨架质粒共转染HEK293细胞,包装获得重组腺病毒,命名为Ad-AE-R2。RT-PCR法和间接免疫荧光法(IFA)对重组腺病毒表达的AE、R2融合蛋白的基因和蛋白表达水平进行鉴定。结果Ad-AE-R2瞬时转染的HEK293细胞中可转录表达AE、R2融合蛋白基因。IFA法采用Ag85B、ESAT-6、Rv2626c和Rv2031c 4种抗原的单克隆抗体可分别检测到Ad-AE-R2感染的巨噬细胞中具有特异性的绿色荧光,表明Ad-AE-R2能够在宿主细胞内表达AE、R2融合蛋白。结论成功构建并包装获得表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白AE、R2的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗研究奠定基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 多阶段抗原 ag85B ESAT-6 Rv2031c Rv2626c 重组腺病毒
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结核杆菌Ag85A重组蛋白的免疫原性研究 被引量:2
3
作者 周晔 蒋天舒 +6 位作者 陈燕 娄加陶 吴传勇 陈波 谷明莉 仲人前 邓安梅 《中国实验诊断学》 2007年第9期1153-1155,共3页
目的探讨纯化的结核杆菌Ag85A重组蛋白激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)免疫应答的能力,为新型结核疫苗的设计打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验,研究纯化的重组表达Ag85A蛋白刺激外周血单个核细胞(PBMC)产... 目的探讨纯化的结核杆菌Ag85A重组蛋白激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)免疫应答的能力,为新型结核疫苗的设计打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验,研究纯化的重组表达Ag85A蛋白刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性,初步鉴定Ag85A重组蛋白的免疫原性。结果以刺激系数(SI)>3为界,Ag85A重组蛋白(10μΜ)能刺激全部12例HL-A*0201阳性(A2+)结核菌素阳性(PPD+)健康个体的PBMC发生增殖(平均SI为56.2±3.6);增殖反应明显高于PPD(平均SI为13.7±3.5)引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在Ag85A重组蛋白诱导的CTL细胞毒活性分析中以负载抗原肽(10μΜ)的T2细胞作为靶细胞,Ag85A重组蛋白诱导的CTL作为效应细胞,Ag85A重组蛋白能诱导全部的12例A2+PPD(+)健康个体中CTL杀伤活性,平均活性分别为(85.2±8.5%),显著高于PPD〔(平均为(21.6±1.7%)〕(P<0.01)诱导的CTL杀伤活性。结论本研究得到的重组优化Ag85A蛋白具有较好的免疫原性,能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性,为进一步开发有效的结核疫苗打下了基础。 展开更多
关键词 结核分支杆菌 ag85a重组蛋白 疫苗
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结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力 被引量:11
4
作者 师长宏 范雄林 +3 位作者 柏银兰 薛莹 张海 徐志凯 《第四军医大学学报》 北大核心 2004年第18期1633-1636,共4页
目的 :研究Ag85B与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护力 .方法 :采用皮下包埋的方法 ,将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠 3次 ,每次间隔 2wk,用MTB培养上清滤液蛋白 (culturefiltrat... 目的 :研究Ag85B与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护力 .方法 :采用皮下包埋的方法 ,将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠 3次 ,每次间隔 2wk,用MTB培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins,CFP)作为抗原 ,ELASA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度 .为了检测融合蛋白免疫小鼠引起的细胞免疫应答 ,最后一次免疫完成后 4wk ,取一部分免疫小鼠分离脾淋巴细胞 ,体外用抗原刺激 ,MTT法检测淋巴细胞刺激反应 ,ELISA检测悬液中IFN γ水平 .另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv ,4wk后计数脾脏细菌负荷数 .结果 :Ag85B ESAT6蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶10 0 0 ,ESAT6 Ag85B蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶5 0 0 0 .融合蛋白Ag85B ESAT6和ESAT6 Ag85B免疫组淋巴细胞刺增殖指数分别为 2 .4 0± 0 .17和 2 .6 0± 0 .2 5 ,而生理盐水组只有 0 .90± 0 .2 1;相对应的IFN γ含量分别为 (3.5 1± 0 .30 ) μg/L和 (4 .0 5± 0 .4 1) μg/L ,显著高与生理盐水对照组 (0 .5 0± 0 .2 5 ) μg/L ,P <0 .0 5 ,但不及BCG免疫组 (5 .5 5±0 .31) μg/L .与生理盐水免疫组 (细菌负荷6 .31± 0 .13)相比较 ,融合蛋白免疫的BALB/c小鼠 。 展开更多
关键词 分支杆菌 结核 疫苗 抗原85B ESAT6 重组融合蛋白质类
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分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗的构建和表达 被引量:5
5
作者 刘洪波 吴少庭 +2 位作者 蔡昌学 甘燕 秦莉 《热带医学杂志》 CAS 2006年第10期1064-1067,共4页
目的构建分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗。方法PCR扩增结核分枝杆菌热休克蛋白60(hsp60)的调控序列和合成T4转录终止序列,分别定向克隆入pBCG2000载体的多克隆位点的上下游,得到E.coli-Mycobacterium穿梭载体质粒pBCG3000。PC... 目的构建分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗。方法PCR扩增结核分枝杆菌热休克蛋白60(hsp60)的调控序列和合成T4转录终止序列,分别定向克隆入pBCG2000载体的多克隆位点的上下游,得到E.coli-Mycobacterium穿梭载体质粒pBCG3000。PCR分别扩增出结核分枝杆菌分泌性抗原Ag85B的全编码序列及ESAT-6基因,然后将两基因融合插入pBCG3000载体的hsp60启动子下游得到pBCG3000-85B-ESAT-6分泌性表达质粒。用电穿孔法将pBCG3000-85B-ESAT-6质粒转化BCG细胞,得到重组卡介苗。重组卡介苗经热诱导后,SDS-PAGE电泳和Westernblotting鉴定融合蛋白85B-ESAT-6的表达及其免疫学活性。结果通过PCR、酶切以及测序鉴定,pBCG3000-85B-ESAT-6表达质粒构建完全正确,SDS-PAGE电泳未能直接观察到表达的融合蛋白条带,用ESAT-6蛋白的多抗血清通过Westernblotting证实了该蛋白主要分泌性表达于胞外并具有免疫学活性。结论分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗构建成功。 展开更多
关键词 融合蛋白 ag85B ESAT-6 重组卡介苗 穿梭质粒
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结核分枝杆菌H37Rv两种抗原Ag85b、HspX的制备及其与佐剂的联合应用 被引量:4
6
作者 陈磊 徐苗 +7 位作者 都伟欣 陈保文 王志玉 王雅君 董娜 苏城 沈小兵 王国治 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期403-409,共7页
目的用分子生物学方法制备H37Rv的两种抗原Ag85b、HspX,通过与铝佐剂和CpG佐剂联用免疫小鼠进行初步药理学实验以观察其生物学活性。方法常规方法分别构建重组表达质粒pET30a-Ag85b和pET30a-HspX,内切酶鉴定目的片段后两种质粒分别转化B... 目的用分子生物学方法制备H37Rv的两种抗原Ag85b、HspX,通过与铝佐剂和CpG佐剂联用免疫小鼠进行初步药理学实验以观察其生物学活性。方法常规方法分别构建重组表达质粒pET30a-Ag85b和pET30a-HspX,内切酶鉴定目的片段后两种质粒分别转化BL-21大肠杆菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后分别产生两种蛋白;用阴离子交换柱Source30、QHP以及疏水层析柱对两种蛋白进行纯化;蛋白测序进行鉴定。纯化后的两种蛋白分别与铝佐剂和CpG佐剂联用(Ag85b,Ag85b+Al,Ag85b+CpG,Ag85b+Al+CpG;HspX,HspX+Al,HspX+CpG,HspX+Al+CpG),免疫C57/BL小鼠,同时设置生理盐水对照组,取脾细胞进行酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测干扰素-γ(IFN-γ)的分泌;同时进行淋巴细胞增殖实验检测脾淋巴细胞经体外刺激后的增殖情况。结果成功构建了两种重组表达质粒pET30a-Ag85b和pET30a-HspX,成功诱导表达了两种蛋白;经过纯化,两种蛋白纯度均达到95%;经鉴定两种蛋白纯化产物的N端15个氨基酸序列与目的序列相同;Ag85b+CpG、Ag85b+Al和Ag85b+CpG+Al组经Ag85b(80μg/ml)体外刺激后分泌IFN-γ显著升高,与生理盐水组比较差异具有显著性(P<0.05);HspX+CpG+Al组经HspX(80μg/ml)体外刺激后分泌IFN-γ显著升高,与生理盐水组比较差异具有显著性(P<0.05)。结论成功表达并纯化了结核分枝杆菌H37Rv的两种抗原Ag85b和HspX,与铝佐剂和CpG佐剂联用后成功刺激小鼠产生了细胞免疫反应,证实了两种重组蛋白的生物学活性,为下一步药效学评估奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 重组蛋白 佐剂 ag85B HSPX
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结核分支杆菌Ag85B融合蛋白表达载体的构建及纯化
7
作者 游力 赵跃然 +1 位作者 许晓群 冯进波 《山东大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2005年第7期570-573,共4页
目的:构建结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌的融合表达载体,制备MBP/Ag85B融合蛋白并将其纯化。方法:常规方法构建重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B,内切酶EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定;重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B转化大肠杆菌,经0.3mmol/L异丙基-β... 目的:构建结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌的融合表达载体,制备MBP/Ag85B融合蛋白并将其纯化。方法:常规方法构建重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B,内切酶EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定;重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B转化大肠杆菌,经0.3mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalactoside熏IPTG)诱导表达产生融合蛋白(MBP/Ag85B),Westernblot鉴定表达产物。pMAL纯化树脂(Amyloseresin)对MBP/Ag85B融合蛋白纯化。结果:重组质粒pMAL-p2-Ag85B经EcoRⅠ/HindⅢ酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳证实Ag85B正向插入pMAL-p2载体,重组菌经IPTG诱导后,有约70kD蛋白表达,与预期的融合蛋白分子量相符,蛋白表达量约占细菌总蛋白量的40%;Westernblot显示,MBP/Ag85B融合蛋白与人抗结核IgG抗体呈特异性反应;经Amyloseresin纯化后,MBP/Ag85B融合蛋白的纯度可达95%以上。结论:成功构建结核分支杆菌Ag85B重组融合蛋白表达质粒并制备及纯化其融合蛋白,为进一步研究Ag85B生物学功能及其抗原表位分析奠定了物质基础。 展开更多
关键词 分支杆菌 结核 基因 ag85B 重组融合蛋白质类
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结核杆菌Ag85A蛋白与日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶的融合表达与纯化 被引量:1
8
作者 杨爱琼 谢勇恩 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2005年第2期101-103,共3页
目的 对结核杆菌Ag85A抗原基因进行克隆、表达与纯化 ,为研制新型结核杆菌血清学诊断试剂奠定基础。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,经PCR扩增Ag85A抗原基因成熟肽编码区 ,定向克隆入原核表达载体pGEX1 λT中日本血吸虫谷胱... 目的 对结核杆菌Ag85A抗原基因进行克隆、表达与纯化 ,为研制新型结核杆菌血清学诊断试剂奠定基础。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,经PCR扩增Ag85A抗原基因成熟肽编码区 ,定向克隆入原核表达载体pGEX1 λT中日本血吸虫谷胱苷肽硫转移酶 (GST)编码区下游构建重组质粒 ,经DNA测序鉴定后 ,转化大肠杆菌JM10 9株 ,IPTG诱导表达 ,采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化 ,SDS -PAGE和Westernblot鉴定重组表达产物。结果 PCR扩增获得了约 90 0bp的目的基因片断 ,定向克隆入原核表达载体pGEX1 -λT后 ,对重组质粒进行DNA测序发现 ,插入片段与GenBank中结核杆菌Ag85A抗原基因成熟肽编码区同源性为 99 .8%。重组质粒转化大肠杆菌后 ,经IPTG诱导表达 ,纯化的融合蛋白相对分子质量为 5 80 0 0 ,Westernblot检测该融合蛋白能与兔抗结核杆菌多价抗血清发生反应。结论 本研究为研制结核杆菌血清学检测试剂盒及相关分子免疫学研究奠定了基础。 展开更多
关键词 结核杆菌 ag85a 日本血吸虫 重组质粒 编码区 基因 谷胱甘肽硫转移酶 A抗原 原基 IPTG
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表达Ag85基因重组卡介苗的构建
9
作者 黄淑芩 黄雯晶 +3 位作者 李文锋 洪锐 黄淑坚 陈勇 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第2期590-596,共7页
为研发一种更安全、有效的结核病疫苗,用于预防并清除结核病,本试验构建4株分别表达Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因的重组卡介苗,参考pMV261载体序列和Tuberculist上登录的H37Rv序列设计引物,通过PCR扩增和无缝克隆技术构建含Ag 85基... 为研发一种更安全、有效的结核病疫苗,用于预防并清除结核病,本试验构建4株分别表达Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因的重组卡介苗,参考pMV261载体序列和Tuberculist上登录的H37Rv序列设计引物,通过PCR扩增和无缝克隆技术构建含Ag 85基因片段的重组pMV261质粒。分别对重组质粒进行PCR、双酶切鉴定后,通过电击转化转染到卡介苗感受态细胞中,利用Kan耐药基因筛选获得重组卡介苗菌株。采用PCR及Western blotting鉴定Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因在卡介苗中的表达,再对构建成功的重组卡介苗进行培养,用于后续试验。PCR扩增结果表明,构建的重组卡介苗rBCG/Ag85A、rBCG/Ag85B、rBCG/Ag85C和rBCG/Ag85D目的基因片段大小分别为1447、1402、1453和1330 bp,与预期大小一致,表明目的基因已成功整合到卡介苗中;Western blotting结果表明,Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因均可在卡介苗细胞内成功表达。本试验利用基因工程技术成功获得4株分别表达Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因的重组卡介苗,将其分别命名为rBCG/Ag85A、rBCG/Ag85B、rBCG/Ag85C、rBCG/Ag85D。本研究可为进一步将其他抗原基因插入卡介苗细胞构建重组疫苗及疫苗研究提供材料。 展开更多
关键词 结核病 ag85蛋白 无缝克隆 重组卡介苗
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Ag85B核酸疫苗的免疫原性和保护性研究 被引量:7
10
作者 呼西旦 蔡宏 +2 位作者 李淑霞 田霞 朱玉贤 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第5期365-368,共4页
扩增结核分枝杆菌的Ag85B基因并克隆于真核表达载体 pJW4 30 4 ,转染COS - 7细胞后 ,Westernblot检测表明该基因在细胞内得到了正确表达。用该质粒免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,免疫三次后 ,用纯化的重组蛋白Ag85B检测小鼠血清中的抗体 ,抗体滴... 扩增结核分枝杆菌的Ag85B基因并克隆于真核表达载体 pJW4 30 4 ,转染COS - 7细胞后 ,Westernblot检测表明该基因在细胞内得到了正确表达。用该质粒免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,免疫三次后 ,用纯化的重组蛋白Ag85B检测小鼠血清中的抗体 ,抗体滴度达到 1:10 2 4 0 0 ,(γ -干扰素测定表明 ,免疫动物的干扰素含量达到 116 0 3± 10 4 pg /ml。实验结果说明Ag85B核酸疫苗在实验动物体内引起了较强的免疫应答。三次免疫后经静脉强毒攻击 ,免疫组小鼠肺脏和脾脏的细菌数比对照空载体组分别减少了 1 5和 15倍以上。本研究表明 ,该核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞和体液免疫应答并获得较高的保护效率。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌病 ag85B分泌蛋白抗原 核酸疫苗 免疫原性 保护效率
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结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达 被引量:5
11
作者 骆旭东 陈全 +2 位作者 蒋英 江山 朱道银 《第四军医大学学报》 北大核心 2003年第12期1088-1090,共3页
目的 :构建结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B MPT6 4融合基因并在真核细胞中表达 .方法 :采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT6 4编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3经PCR扩增融合 ,定向克隆入 pcDNA3.1(+)中 .采用脂质体转染法将pcDNA/A... 目的 :构建结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B MPT6 4融合基因并在真核细胞中表达 .方法 :采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT6 4编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3经PCR扩增融合 ,定向克隆入 pcDNA3.1(+)中 .采用脂质体转染法将pcDNA/Ag85B MPT6 4 (pcDNA/AM )转染COS 7细胞 ,用RT PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达 .结果 :Ag85B MPT6 4融合基因经双向DNA序列测定 ,碱基突变率为 0 .11%(2 /170 7) ,突变为无意义突变 ;重组质粒转染COS 7细胞后经检测证实 ,该融合基因能在真核细胞中表达 .结论 :成功地构建了Ag85B MPT6 4融合基因并在真核细胞中表达 。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 ag85B MPT64 重组融合蛋白质类
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结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的高效表达 被引量:1
12
作者 罗一鲁 陈建波 +2 位作者 冯蝶仪 谭守勇 陈郁筠 《热带医学杂志》 CAS 2004年第4期382-384,共3页
目的通过结核分支杆菌Ag85B蛋白编码基因在大肠杆菌中稳定表达,以获得大量纯化的Ag85B蛋白。方法采用DNA重组技术构建结核分支杆菌Ag85B基因的表达载体,双酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定重组子,阳性重组子转化大肠杆菌,并诱导表达外源蛋... 目的通过结核分支杆菌Ag85B蛋白编码基因在大肠杆菌中稳定表达,以获得大量纯化的Ag85B蛋白。方法采用DNA重组技术构建结核分支杆菌Ag85B基因的表达载体,双酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定重组子,阳性重组子转化大肠杆菌,并诱导表达外源蛋白。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中的表达,对染色的凝胶扫描,以测定目的蛋白表达水平。结果菌体蛋白经SDSPAGE,含阳性重组质粒的菌体蛋白中出现一条新蛋白带,表达量占菌体总蛋白的33%~38%。Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中表达方式主要是包涵体形式。结论构建的大肠杆菌重组体能高效表达结核分支杆菌Ag85B蛋白抗原。 展开更多
关键词 分支杆菌 抗原 ag85B基因 重组
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分枝杆菌Ag85研究进展 被引量:3
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作者 李晖 钟森 张建军 《国外医学(预防.诊断.治疗用生物制品分册)》 2001年第2期58-61,共4页
抗原 8 5复合体 ( Ag85)是一组具有较强细胞免疫及体液免疫活性的分枝杆菌分泌性蛋白。近年来 Ag85在分布、结构、生化特性、功能及用途方面的研究有了很大进展 ,提示 Ag85在结核和麻风病的预防及诊断方面具有良好的应用前景。
关键词 分枝杆菌 ag85 分泌性蛋白 纤连蛋白 结合抗原
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牛分支杆菌ag85b基因原核表达载体的构建
14
作者 蒋成砚 谢昆 +3 位作者 罗家琴 柴俊 王生奎 张以芳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第4期121-123,共3页
为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoRⅠ及SalⅠ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 D... 为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoRⅠ及SalⅠ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoRⅠ及SalⅠ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。 展开更多
关键词 牛分支杆菌 抗原 ag85B 基因重组
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结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及表达质粒构建 被引量:1
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作者 刘俊华 冯蝶仪 +1 位作者 陈建波 陈郁筠 《国外医学(临床生物化学与检验学分册)》 2003年第5期298-299,共2页
目的 克隆并构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应 (PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B基因 (978bp) ,并克隆到T载体 ,然后用双内切酶消化后 ,与同样酶消化的pGEX 4T 2连接 ,转... 目的 克隆并构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应 (PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B基因 (978bp) ,并克隆到T载体 ,然后用双内切酶消化后 ,与同样酶消化的pGEX 4T 2连接 ,转入大肠杆菌E .coliDH5α,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符 ,测序结果与文献报道一致 ,证实符合表达框架。结论 成功地克隆并构建了Ag85B基因的重组表达质粒 pGEX Ag85BV。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 抗原 ag85B 基因重组
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Al(OH)_(3)和CpG寡核苷酸免疫佐剂对结核分枝杆菌Ag85B蛋白免疫原性的影响
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作者 张光磊 王玉冲 +7 位作者 吴智远 李朋伟 张婷婷 李睿 李奇蒙 王婷 王彩霞 焦磊 《微生物学免疫学进展》 CAS 2024年第3期10-16,共7页
目的 探究Al(OH)_(3)和CpG寡核苷酸免疫佐剂对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Ag85B蛋白免疫原性的影响。方法 将Mtb Ag85B蛋白在大肠埃希菌中进行重组表达,经亲和层析纯化后分别与Al(OH)_(3)、CpG寡核苷酸(简称CpG)及Al(... 目的 探究Al(OH)_(3)和CpG寡核苷酸免疫佐剂对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Ag85B蛋白免疫原性的影响。方法 将Mtb Ag85B蛋白在大肠埃希菌中进行重组表达,经亲和层析纯化后分别与Al(OH)_(3)、CpG寡核苷酸(简称CpG)及Al(OH)_(3)和CpG组成的复合佐剂[Al(OH)_(3)+CpG]配伍,经皮下免疫BALB/c小鼠,初免后28 d加强免疫1次,分别于初免后14、42和56 d采集免疫血清,采用ELISA检测血清中Ag85B特异性IgG、lgG1、IgG2a和IgG2b水平;初免后42 d,每组取4只小鼠无菌分离脾淋巴细胞,利用酶联免疫斑点检测各组细胞中分泌γ干扰素和白介素4的淋巴细胞数量,采用流式细胞术检测各组细胞中CD4^(+)T和CD8^(+)T淋巴细胞的比例。结果 1.5μg或4.5μg Ag85B重组蛋白与Al(OH)_(3)+CpG配伍免疫后均诱导了高水平的Ag85B特异性IgG,免疫效果优于该蛋白与2种佐剂单独配伍组。1.5μg或4.5μg Ag85B重组蛋白与Al(OH)_(3)+CpG配伍免疫血清中IgG亚型为IgG1、IgG2a和IgG2b混合型,其中IgG2a和IgG2b水平均高于Al(OH)_(3)配伍免疫组,差异均有统计学意义(P均<0.001)。酶联免疫斑点检测显示,4.5μg Ag85B重组蛋白与Al(OH)_(3)+CpG配伍免疫小鼠的脾淋巴细胞中分泌γ干扰素和白介素4的淋巴细胞数量均高于Al(OH)_(3)配伍免疫组,差异均有统计学意义(P均<0.05);流式细胞术检测显示,1.5μg或4.5μg Ag85B重组蛋白与Al(OH)_(3)+CpG配伍免疫小鼠的T淋巴细胞中CD4^(+)T淋巴细胞的占比均高于Al(OH)_(3)配伍免疫组。结论 Al(OH)_(3)和CpG联合使用可能协同增强Ag85B重组蛋白的免疫原性。 展开更多
关键词 佐剂 Al(OH)_(3) CPG寡核苷酸 结核分枝杆菌 ag85B重组蛋白 免疫原性 IgG 淋巴细胞
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分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗菌株的筛选 被引量:5
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作者 师长宏 徐志凯 +3 位作者 朱德生 李元 柏银兰 薛莹 《中华结核和呼吸杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期254-257,共4页
目的筛选获得分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗(BCG)菌株。方法采用多聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌毒株H37Rv中扩增出热休克蛋白60(Hsp60)基因及其信号肽序列αss,将测序正确的hsp60和αss基因分别克隆入大肠杆菌(E.co... 目的筛选获得分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗(BCG)菌株。方法采用多聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌毒株H37Rv中扩增出热休克蛋白60(Hsp60)基因及其信号肽序列αss,将测序正确的hsp60和αss基因分别克隆入大肠杆菌(E.coli.)BCG穿梭载体pOLYG中,构建分枝杆菌分泌表达载体pDE22,按相应的酶切位点将ag85b和esat6按照不同的连接方式联合克隆入pDE22载体,分别命名为pDE22Ag85B ESAT6和pDE22ESAT6Ag85B,将纯化的重组质粒电穿入BCG,经潮霉素抗性筛选和PCR的方法鉴定出含目的基因的重组BCG阳性克隆。收集重组BCG的培养上清液,经浓缩和透析后,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)和固相化蛋白质免疫学测定(Western blot法)分析。结果两株重组BCG菌株的培养上清液分泌表达相对分子质量约37000的蛋白,且分别可与抗Ag85B和抗ESAT6蛋白免疫小鼠的血清有相应的结合条带。结论分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组BCG菌株构建成功,有望为结核病的预防提供有效的疫苗。 展开更多
关键词 ag85B 融合蛋白 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 重组卡介苗 WESTERN-BLOT法 菌株 聚合酶链反应(PCR) 卡介苗(BCG) 重组BCG ESAT6蛋白 培养上清液 结核分枝杆菌 分泌表达载体 相对分子质量 信号肽序列 热休克蛋白 H37RV
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分泌融合蛋白Ag85B-ESAT-6重组卡介苗在小鼠体内的免疫效应 被引量:2
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作者 刘洪波 蔡昌学 +1 位作者 吴少庭 甘燕 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2009年第5期333-336,共4页
目的研究分泌融合蛋白Ag85B-ESAT-6重组卡介苗(rBCG)在小鼠体内诱导的免疫效应。方法以2×106CFU的rBCG或BCG皮下接种BALB/c小鼠,免疫后第4、6、8周时用ELISA测定TB-PPD特异的血清抗体滴度;分离脾淋巴细胞,以流式细胞术测定CD4+和CD... 目的研究分泌融合蛋白Ag85B-ESAT-6重组卡介苗(rBCG)在小鼠体内诱导的免疫效应。方法以2×106CFU的rBCG或BCG皮下接种BALB/c小鼠,免疫后第4、6、8周时用ELISA测定TB-PPD特异的血清抗体滴度;分离脾淋巴细胞,以流式细胞术测定CD4+和CD8+T细胞亚群百分比;TB-PPD刺激后以MTT法测定淋巴细胞增殖程度,ELISA检测诱生IFN-γ和IL-10水平。结果rBCG和BCG免疫组小鼠血清特异性抗体滴度分别达1∶5 120和1∶2 560,差异有统计学意义(q=3.89,P=0.034)。rBCG组的IFN-γ水平在第8周达最高(597.1 pg/ml),同期BCG组为416.7 pg/ml,差异有统计学意义(q=10.60,P<0.01)。rBCG组IL-10水平第4周和第6周时也高于BCG组(P<0.05),第8周回落。除第6周外,rBCG组的淋巴细胞增殖指数都高于BCG组(P<0.05)。第8周rBCG组和BCG组CD4+T亚群分别占(71.1±2.6)%和(62.3±2.0)%,差异有统计学意义(q=4.16,P=0.026);CD8+T亚群分别占(35.9±1.7)%和(26.9±2.8)%,差异有统计学意义(q=4.52,P=0.019)。结论融合蛋白Ag85B-ESAT-6引入BCG增强了其抗MTB反应。 展开更多
关键词 融合蛋白 抗原85B ESAT-6 重组卡介苗
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Ag43/GFP嵌合表达质粒的构建及其在大肠杆菌表面的表达
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作者 黄用豪 赵焕阁 +3 位作者 周松林 林映莹 谭光宏 黄风迎 《广东医学》 CAS 北大核心 2015年第4期517-521,共5页
目的构建大肠杆菌抗原Ag43(p ETAg43')以及Ag43和绿色荧光蛋白(GFP)(p ETAg43'/GFP)的重组表达质粒,了解p ETAg43'/GFP是否能够将GFP表达于细菌表面。方法用PCR扩增获得Ag43大部分基因序列(Ag43'),同时用酶切方法从质粒... 目的构建大肠杆菌抗原Ag43(p ETAg43')以及Ag43和绿色荧光蛋白(GFP)(p ETAg43'/GFP)的重组表达质粒,了解p ETAg43'/GFP是否能够将GFP表达于细菌表面。方法用PCR扩增获得Ag43大部分基因序列(Ag43'),同时用酶切方法从质粒p EGFP-C1切取GFP基因序列,首先将Ag43'基因序列插入表达质粒p ET-22b中,获得重组质粒p ETAg43',然后再将GFP基因序列插入p ETAg43'获得质粒p ETAg43'/GFP。将重组质粒p ETAg43'/GFP转化Ag43基因缺失的菌株JM109(△Ag43),用荧光显微镜和SDS-PAGE了解是否能将GFP表达于细菌表面,同时了解加热是否能够直接获得Ag43'/GFP的嵌合重组蛋白。结果琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增的Ag43'和GFP基因序列分子量大小与预期值相一致,酶切分析重组质粒p ETAg43'和p ETAg43'/GFP结果与预期值相符,基因测序显示质粒p ETAg43'和p ETAg43'/GFP的基因序列和阅读框架均准确无误。质粒p ETAg43'/GFP经诱导后可以将Ag43'/GFP嵌合蛋白表达于大肠杆菌JM109(△Ag43)的表面,55℃加热50 min是提取Ag43'/GFP嵌合蛋白的最佳条件。结论成功构建了能够将外源蛋白GFP表达于细菌表面的重组表达载体,在大肠杆菌表面有效表达并加热提取获得了嵌合重组蛋白Ag43'/GFP,为制备其他自身抗原分子的Ag43嵌合蛋白奠定了基础。 展开更多
关键词 抗原ag43 绿色荧光蛋白 嵌合重组蛋白 重组表达质粒 细菌表面表达
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结核分枝杆菌特异性分泌抗原克隆和融合表达及抗原性鉴定
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作者 娄培安 章辉 +4 位作者 刘加彬 王晓婷 周艳秋 赵广法 朱荫昌 《中国校医》 2006年第1期1-6,共6页
目的融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10,研究其免疫学特性,为结核病的血清学诊断提供物质基础。方法将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c(+)中,构建pET32c(+)-linker。PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因... 目的融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10,研究其免疫学特性,为结核病的血清学诊断提供物质基础。方法将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c(+)中,构建pET32c(+)-linker。PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因。将CFP10克隆入改建的载体pET32c(+)的linker前,ESAT-6克隆入linker后,构建CFP10-ESAT-6融合基因;或将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c(+)linker前,CFP10克隆入linker后,构建ESAT-6-CFP10融合基因,分别转化大肠杆菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠肝菌BL21中表达,通过Westernblot分析其抗原性。结果二个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c(+)的linker前或后。重组质粒pET32c(+)-CFP10-ESAT-6或pET32c(+)-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。融合蛋白在BL21菌中高效表达。Westernblot分析表明,融合蛋白与活动性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应。结论成功地构建了多抗原基因DNA质粒;pET32c(+)-CFP10-ESAT-6或pET32c(+)-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白,该蛋白兼具CFP10和ESAT-6二种蛋白的抗原性。本研究为rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白在结核病血清学诊断的中应用奠定了基础。 展开更多
关键词 CFP-10蛋白(71—85) 结核杆菌 6-kDa早期分泌性抗原 重组蛋白 血清学检验
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