多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗诱导小鼠脾细胞因子的变化

目的:探讨多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫后再以Em原头节攻击后小鼠脾细胞因子的变化。方法:将疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB/c小鼠后8周,用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染。感染后18周杀鼠取脾,分离脾细胞,用EmAg或ConA刺激培养,并收集脾细胞培养上清液,用试剂盒检测脾细胞培养上清液中IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4的水平,同时设有空载体、BCG和PBS对照。结果:疫苗接种组的IFN-γ和TNF-α水平升高,IL-4水平降低;皮下注射组的TNF-α水平高于鼻腔内接种组。结论:多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗可诱导小鼠产生Th1型细胞应答,抵抗Em原头节的攻击感染。疫苗皮下注射途径优于鼻腔内接种。

多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗构建及其表达效率

目的 构建多房棘球绦虫（Em）重组卡介苗（BCG—EmⅡ／3）疫苗，分析EmⅡ／3分子在该疫苗中的表达效率。方法 超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA，通过RT-PCR扩增EmⅡ／3的抗原编码基因；将该基因定向克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG，构建重组质粒pBCG—EmⅡ／3；电穿孔法转化BCG，构建多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ／3疫苗。免疫印迹分析重组BCG-EmⅡ／3疫苗的表达产物。结果 RT-PCR成功扩增出1680bp的EmⅡ／3抗原编码基因；双酶切证实EmⅡ／3抗原编码基因成功插入pBCG中；PCR证实rBCG—EmⅡ／3疫苗构建成功；免疫印迹分析发现重组BCG—EmⅡ／3疫苗的表达产物在相对分子质量（Mr）约为65×10^3处有明显的目的蛋白表达条带，且能被活动性泡球蚴病鼠血清特异识别。结论 成功构建了多房棘球绦虫重组BCG—EmⅡ／3疫苗，为疫苗的开发和利用打下了坚实的理论基础。

重组BCG的抑瘤活性及免疫学机制研究

目的:对重组GM-CSF和EB病毒LMP2A融合基因的BCG(卡介苗)进行抑瘤活性及免疫学机制研究。方法:建立EB病毒阳性肿瘤动物模型,对小鼠成瘤时间、存活情况、肿瘤重量进行分析,检测重组BCG的抑瘤活性;用ELISA方法对重组BCG刺激机体产生的特异性抗体进行检测,乳酸脱氢酶法检测特异性CTL杀伤效应,ELISPOT法检测IFN-γ的分泌水平,流式细胞术、HE染色检测重组BCG免疫小鼠的肿瘤组织中的淋巴细胞浸润情况。用统计学方法对重组BCG免疫效果进行初步分析和评价。结果:肿瘤成瘤时间与其他对照相比明显延迟,肿瘤生长明显缓慢,小鼠生存期延长。ELISA检测结果表明,重组BCG免疫后能产生针对GM-CSF和LMP2A的特异性Ig G抗体,重组BCG免疫组的小鼠能检测到特异性CTL活性,用ELISPOT法检测到免疫小鼠淋巴细胞有IFN-γ分泌;流式细胞术及形态学观察的方法检测到重组BCG免疫的小鼠肿瘤组织中有淋巴细胞的浸润生长。结论:重组BCG诱导C57BL/6小鼠机体产生了体液免疫和细胞免疫反应,重组BCG对EB病毒阳性肿瘤细胞具有明显抑制作用。

重组BCG联合抗痨药物对小鼠结核病治疗作用的实验研究

目的:探讨携带编码人天然颗粒溶素(Granulysin,GLS)和小鼠IL-12基因的重组BCG与抗痨药物对结核分枝杆菌感染的协同治疗效果。方法:将结核分枝杆菌H37Rv感染的BALB/c小鼠40只随机分成4组。感染4周后分别用生理盐水、重组卡介苗(BCG)、INH+PZA和重组BCG联合INH+PZA治疗,于第一次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-γ、肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果:重组BCG联合INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量(logCFU/g)比重组BCG和INH+PZA治疗组显著降低;重组BCG和INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量比生理盐水组显著降低。重组BCG组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组。重组BCG联合INH+PZA治疗组和重组BCG组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于生理盐水组。重组BCG组用免疫组化检测到小鼠肺及脾组织中GLS的表达。重组BCG和INH+PZA组病变轻且局限,生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛。重组BCG联合INH+PZA治疗组肺组织病变最轻。结论:GLS/IL-12重组BCG对小鼠结核病有一定免疫治疗作用;重组BCG联合临床常用的抗痨药可增强抗结核病的疗效。

多房棘球绦虫重组BCG—EmⅡ／3疫苗诱导小鼠脾细胞亚群变化的研究

目的 探讨多房棘球绦虫重组BCG—EmⅡ／3疫苗免疫和多房棘球绦虫（Em）原头节攻击后小鼠脾CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞亚群的变化。方法 Balb／c小鼠随机分为疫苗皮下注射组、鼻腔接种组、空载体对照组、卡介苗（BCG）对照组和磷酸缓冲液（PBS）对照组。疫苗免疫8周时用Em原头节进行攻击，感染后18周杀鼠取脾，分离脾细胞，流式细胞仪检测脾CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞亚群的百分比。结果 疫苗皮下注射组和鼻腔接种组的脾CD4^＋T细胞亚群比值分别为0．345±0．018、0．314±0．014，与PBS对照组（0．216±0．027）比较明显增高（q值分别为3．93、3．76，P〈0．01）；CD8^＋T细胞亚群比值分别为0．091±0．005、0．083±0．007，与PBS对照组（0．085±0．018）比较无明显变化（q值分别为0．92、0．89，P〉0．05）；CD4^＋／CD8^＋亚群比值分别为3．81±0．30、3．80±0．44，与PBS对照组（2．75±1．08）比较明显增高（q值分别为3.25、3．06，P〈0．01）。皮下注射组的CD4^＋和CD8^＋T细胞亚群数目显著高于鼻腔内接种组（q值分别为3．52、2．63，P〈0．01或〈0．05）。结论 CD4^＋T细胞亚群在多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ／3疫苗诱导的小鼠抗Em原头节攻击感染的保护性免疫机制中起关键作用。

结核分支杆菌重组BCG疫苗研究进展

结核分支杆菌引起的结核病是一种人兽共患的慢性传染病,短程督导化疗是治疗该病的主要措施,卡介苗是预防该病的唯一疫苗,但其免疫效果极不稳定。文章介绍了7种结核分支杆菌重组BCG疫苗构建及其免疫机制等方面的研究进展。

多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗不同接种途径诱导小鼠细胞因子的研究

目的探讨多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗免疫和Em原头节攻击后小鼠脾细胞因子的变化。方法将疫苗通过皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB/c鼠,免疫后8周用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染,感染后18周杀鼠取脾,分离脾细胞,用EmAg或ConA刺激培养,收集脾细胞培养上清液,用试剂盒检测脾细胞培养上清液的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平,同时设有PBS对照。结果疫苗接种组的IFN-γ和TNF-α水平升高,IL-4水平降低;鼻腔内接种组的TNF-α水平高于皮下注射组。结论多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗诱导小鼠产生一个TH1型反应,从而对抗Em原头节攻击感染;疫苗鼻腔内接种是一种较好的免疫途径。

多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗促进小鼠脾细胞因子的分泌

目的动态观察多房棘球绦虫重组BCG—EmⅡ／3疫苗免疫小鼠后脾细胞因子的变化。方法采用鼻腔内接种疫苗免疫BALB／C鼠，在免疫后0、2、4、6、8和10周各剖杀4只小鼠取脾，分离脾细胞，用EmAg或ConA刺激培养，收集脾细胞培养上清液，检测脾细胞培养上清液中的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平，同时设有PBS对照。结果疫苗接种组中IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4分别在免疫后2～6、2～6、2—10和8～10周升高，分别在免疫后4、4、8和10周达最高水平。结论多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ／3疫苗在免疫早期（2～8周）即可诱导小鼠产生一个TH1型保护性免疫反应。

胞壁形式表达融合蛋白Der p2-PEB1重组BCG的构建和鉴定

利用重组BCG技术,构建能以胞壁形式表达屋尘螨Der p2和PEB1抗原的重组BCG口服哮喘疫苗pCW-Der p2-PEB1-rBCG,以pCW-Der p2质粒和pUC-PEB1质粒DNA为模板扩增基因,构建出重组质粒pCW-Der p2-PEB1。将重组质粒电穿导入BCG感受态细胞,潮霉素抗性筛选rBCG阳性克隆。阳性rBCG经PCR特异性扩增目的基因片段Der p2及PEB1,证实其中含有目的基因。用抗Der p2单克隆抗体和制备的小鼠PEB1抗血清对rBCG进行间接免疫荧光鉴定。结果成功扩增了Derp2及PEB1基因,构建出重组质粒pCW-Der p2-PEB1,并将质粒电穿入BCG中,免疫荧光法鉴定其成功。说明成功地构建了胞壁表达Derp2-PEB1融合蛋白重组BCGpCW-Der p2-PEB1-rBCG。为基因工程疫苗的研制奠定了基础。

日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗对小鼠免疫应答的影响

采用日本血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。免疫８周时，断头取血，取脾脏，取腹腔巨噬细胞。以淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）反映细胞增殖能力，以ＮＯ湫得检测巨噬细胞吞噬活性，以ＥＬＩＳＡ试剂盒检测血清及脾淋巴细胞培养上清的白细胞介素２（ＩＬ－２＿和干扰素γ（ＩＦＮ－γ）的含量。结果表明，ｒＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗以１０＾－６ＣＦＵ剂量经皮下免疫小鼠后。

多房棘球绦虫重组BCG—Em14—3—3疫苗对小鼠脾细胞凋亡的影响

目的 检测多房棘球绦虫（Em）重组BCG—Em14—3—3疫苗对原头蚴攻击小鼠脾细胞凋亡的影响。方法 用重组BCG—Em14—3—3疫苗免疫Balb／c小鼠8周后，用50个多房棘球绦虫原头蚴腹腔注射进行攻击，攻击感染后18周剖杀小鼠．分离脾细胞，用刀豆素A（ConA）刺激培养16～18h，然后用Annexin V—FITC染色法检测脾细胞凋亡。结果 小鼠脾细胞原液组和ConA刺激组细胞凋亡发生率均显著低于磷酸缓冲液（PBS）对照组（P〈0．05或〈0．01）：鼻腔黏膜接种组脾细胞凋亡率显著低于皮下注射组（P〈0．01）；重组BCG疫苗组脾细胞凋亡率显著低于pCD—Em10 DNA疫苗肌肉注射组（P〈0．01）。结论 多房棘球绦虫重组BCG—Em14—3—3疫苗可抑制感染鼠脾细胞发生凋亡．增加CD4^＋细胞亚群的数量，加强宿主抗多房棘球绦虫感染的保护性免疫反应。

多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ／3和BCG-Em14-3-3疫苗诱导的保护力观察

目的:探讨多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠后对Em原头节攻击感染的保护性作用。方法:将混合重组BCG疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB/c鼠,免疫后8周用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染,感染后18周剖杀小鼠,计算减蚴率,测定血清中IgG及其亚类和IgE水平,同时设有空载体、BCG和PBS对照。结果:混合疫苗接种组的减蚴率为45.29%～76.47%,血清IgG、IgG2a、IgG2b和IgE水平明显升高,IgG1和IgG3显著降低。结论:多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗鼻腔内接种是一种较好的途径,IgG、IgG2a、IgG2b和IgE在疫苗诱导的保护力中起重要作用。

抗艾滋病分泌型重组BCG疫苗的研究进展

抗艾滋病分泌型重组ＢＣＧ疫苗，是一种含有分泌融合蛋白质的牛分枝杆菌ＢＣＧ菌的疫苗。融合蛋白质是由外来抗原肽（艾滋病毒表面抗原肽）插入含有信号肽的载体蛋白（抗酸菌的α抗原）分子表面得到的。该疫苗能有效地诱导杀伤Ｔ细胞，显著提高抗体水平，用于艾滋病的预防和治疗。

Ipr1/PPE68重组BCG诱导BALB/C小鼠免疫应答的探讨

目的构建Ipr1/PPE68重组卡介苗(Recombinant BCG,rBCG),探讨其诱导BALB/C小鼠免疫应答的效果。方法将Ipr1和PPE68基因及结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)复制子OriM分别插入pBudCE4.1的多克隆位点,构建共表达穿梭质粒pBIPO,将其电转入BCG,构建Ipr1/PPE68-rBCG并将rBCG免疫BALB/C小鼠,检测小鼠血清中IgG2a、IL-12、IFN-γ及IL-4的水平、特异性脾淋巴细胞增殖和CD4+和CD8+T细胞数量,同时观察脾、肺荷菌量及脾、肺组织病理学变化。结果酶切测序及菌落PCR鉴定Ipr1和PPE68以及OriM基因序列与理论值相符,Western-blotting结果显示Ipr1和PPE68蛋白成功表达。Ipr1/PPE68-rBCG免疫小鼠后,血清中的IgG2a和IL-12水平及脾淋巴细胞增殖情况明显高于对照组,但与BCG组相比没有显著意义;IFN-γ水平显著低于BCG组,与对照组相比无显著性差异;各组别IL-4的水平差异均不明显。脾、肺荷菌实验未见菌落生长,肺、脾组织未见病理学改变。结论成功构建Ipr1/PPE68-rBCG,该重组BCG能诱导BALB/C小鼠的细胞免疫应答。

重组BCG疫苗在传染病防治中的应用

卡介苗(Bacille Calmette-Guérin,BCG)作为预防结核病的重要手段,已证明其对人体安全,且接种效果不受母体抗体的影响,成为WHO推荐的两种新生的活疫苗之一.BCG本身是强免疫佐剂,临床上常用于肿瘤治疗.近年来国内外学者以BCG为疫苗载体,将具有免疫保护作用的外源基因转入BCG[1],希望开发在BCG中表达保护性抗原或免疫因子的新一代活疫苗,以达到增强BCG免疫原性和一苗多用的目的.本文就重组BCG疫苗在传染病防治中的应用作一综述.

抗结核重组BCG疫苗研究进展

结核病仍是严重威胁人类健康的传染病之一,卡介苗(mycobacterium bovis bacillus calmette-guérin,BCG)是唯一被批准用于结核病预防的疫苗,但近年来的研究发现其免疫保护效果极不稳定,构建重组BCG成为目前新型抗结核疫苗研究的重要方向之一。本文概括性地介绍了抗结核重组BCG疫苗研究的必要性、抗结核重组BCG的研究策略与研究进展以及存在的问题和未来展望。

重组BCG抗结核作用增强

牛型结核分支杆菌减毒活疫苗BCG(bacille Calmette-Guérin)和田鼠分支杆菌都缺乏有效的、分泌型的T细胞抗原ESAT-6(6-kDa early secretory antigenic target)和CFP-10(10-kDa culture filtrate protein)。这是缺失区1(RD1)基因座中基因独立缺失的结果，

HCV多表位基因重组BCG的筛选及对其诱导的免疫应答研究

目的将丙型肝炎病毒（HCV）多表位基因的穿梭质粒pDE22-CtEm电转化BCG，筛选重组BCG（rBCG），免疫BALB／c小鼠，研究其诱导的免疫应答。方法培养并制备BCG感受态，将重组穿梭质粒pDE22-CtEm电转化BCG，筛选rBCG。rBCG免疫小鼠，同时进行基因免疫，测定血清中特异性抗体，分离小鼠脾淋巴细胞，体外测定淋巴细胞刺激指数、IFN-γ和进行CTL杀伤实验，观察rBCG在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答。结果筛选出HCV多表位基因rBCG，免疫小鼠后在小鼠体内诱导出特异性的体液和细胞免疫应答，免疫应答水平均高于重组的基因免疫。结论构建的HCV多表位抗原rBCG活疫苗优于基因疫苗。