重组结核分枝杆菌CFP10蛋白对A549细胞TLR信号途径介导的炎症反应的影响

本研究旨在检测重组结核分枝杆菌10 ku培养滤液蛋白(culture filtrate protein 10, CFP10)对肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549细胞Toll样受体(TLRs)信号途径及其介导的炎症反应的影响。PCR扩增cfp10目的基因片段,构建重组质粒载体pCzn1-CFP10。将重组质粒pCzn1-CFP10转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白CFP10(rCFP10)并鉴定,纯化rCFP10,去除内毒素及脱盐备用。设置对照组,利用MTT检测rCFP10对A549细胞的存活率的影响;通过qRT-PCR、Western blot及ELISA等技术,分别在转录和翻译水平检测rCFP10对A549细胞TLRs信号途径关键分子及其下游炎症因子表达的影响。结果显示,成功构建重组表达载体pCzn1-CFP10并表达纯化出高纯度的rCFP10。MTT结果显示,随着rCFP10浓度增加和处理时间延长,A549细胞存活率显著降低。与空白对照组相比,rCFP10分别从转录和翻译水平显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调A549细胞中TLRs途径关键分子TLR2、TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65及下游炎症因子IL-6、TNF-α的表达水平。rCFP10蛋白可以通过激活A549细胞TLRs受体信号途径促进细胞炎症因子的分泌,这将为进一步加深理解结核病发病机制提供理论依据。

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的克隆表达及效价测定

目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区CFP10-ESAT6融合蛋白,测定融合蛋白对结核分枝杆菌致敏豚鼠的效价。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv为模板,采用Overlap PCR方法扩增CFP10-ESAT6融合基因,并克隆入pET-30a质粒,IPTG诱导工程菌表达融合蛋白,离子层析柱分离纯化融合蛋白。以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定。结果结核分枝杆菌融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,融合蛋白占总菌体蛋白的30%以上,经离子层析柱纯化纯度达95%以上。重组蛋白可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,2.5μg/ml重组蛋白诱导豚鼠皮试反应与TB-PPD(50 IU/ml)等效。结论重组融合蛋白有望成为结核感染皮试诊断用新试剂。

重组CFP10-ESAT6蛋白通过TLR信号介导A549细胞抗BCG感染

本研究旨在探究重组CFP10-ESAT6蛋白在结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染肺泡上皮细胞过程中对肺泡上皮细胞TLR信号途径及其介导的炎症反应的影响。利用原核表达系统表达纯化Mtb重组蛋白CFP10-ESAT6,使用重组蛋白处理A549细胞,利用CCK-8试剂盒检测重组CFP10-ESAT6对细胞活性的影响;使用重组CFP10-ESAT6和减毒牛分支杆菌BCG处理细胞并设置相应组别,提取细胞总RNA和总蛋白,利用qRT-PCR技术、Western-blot及ELISA方法分别从转录和翻译水平检测A549细胞中TLR信号途径关键分子及其下游炎症因子的表达变化。结果显示,成功获得高纯度的重组CFP10-ESAT6,并且重组CFP10-ESAT6在一定浓度范围和处理时间条件下能够降低A549细胞的存活率。当BCG或重组CFP10-ESAT6单独处理A549细胞时,细胞中TLR2、TLR4、My D88、TRAF6和NF-κB p65及下游炎症因子IL-6和TNF-α的表达水平显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调,重组CFP10-ESAT6与BCG共处理时,重组CFP10-ESAT6显著(P<0.05)降低了由BCG刺激所导致的TLR途径关键分子TLR2、TLR4、My D88、TRAF6、NF-κB p65、IL-6及TNF-α等炎症因子的表达水平。上述结果表明,重组CFP10-ESAT6可以减轻A549细胞在抗Mtb感染过程中由TLR信号介导的炎症因子的分泌,这将为进一步加深理解结核病发病机制提供理论依据。