重组CP多克隆抗体在马铃薯卷叶病毒DAS-ELISA检测中的应用

先经过饱和硫酸铵沉淀分离,再用Protein G亲和层析柱纯化,从马铃薯卷叶病毒(PLRV)重组CP作抗原制备的抗血清中获得了高纯度多克隆抗体(IgG),并用戊二醛法一步法进行碱性磷酸酶的标记获得了酶标抗体(IgG-AP)。将纯化的抗体与酶标抗体用于感染PLRV病叶的检测,DAS-ELISA反应呈阳性,结果表明,用重组CP制备的多克隆抗体可成功地用于PLRV的DAS-ELISA检测。本研究为PLRV重组CP多克隆抗体的大量制备及ELISA检测奠定了基础。

基于微小隐孢子虫重组CP15/60蛋白的间接ELISA检测方法的建立及上海市猪隐孢子虫感染情况调查

为建立敏感、特异的猪隐孢子虫感染血清学检测方法,了解上海市猪隐孢子虫感染情况,以纯化的重组CP15/60(r CP15/60)为诊断抗原,建立了检测隐孢子虫感染的间接ELISA方法,并对上海市猪隐孢子虫感染情况进行血清学调查。结果显示,与Nested PCR方法检测结果相比,本研究建立的r CP15/60-ELISA方法的阴阳性符合率为83.3%,敏感性为100%,特异性为80%;重复性试验的变异系数在12.5%之内;对341份猪田间血清进行检测,阳性为194份,占56.89%,表明该方法可用于实验室初步诊断和现场猪隐孢子虫病的流行病学调查。

马铃薯A病毒重组CP多克隆抗体的制备及其在DAS-ELISA检测中的应用

利用重组CP作抗原制备出马铃薯A病毒的多克隆抗体,并将其用于DAS-ELISA检测。以p ET22b(+)为起始载体,构建了PVA-CP基因的原核表达载体p ET22b-ACP,重组菌BL21(p ET22b-ACP)经IPTG诱导表达出了分子量为30 k Da的特异性重组CP。利用高纯度重组CP为抗原免疫家兔,制备出了效价为1∶512 k的抗血清。以PVA重组CP为抗原,用间接ELISA与直接ELISA分别测定重组CP纯化抗体(Ig G)及其碱性磷酸酶标记物(Ig G-AP)的活性,用DAS-ELISA测定2种抗体的活性,目测及OD值测定结果表明3种ELISA测定反应都呈阳性。以PVA病毒阳性标准物为抗原,在上述3种ELISA测定中也呈阳性反应,重组CP多克隆抗体及其酶标抗体与PVA有较强的反应信号。利用重组CP制备的多克隆抗体及其酶标抗体达到了马铃薯A病毒DAS-ELISA检测的要求。

纯化马铃薯S病毒原核表达重组CP的简便方法

用PVS-CP基因的原核表达载体pBAD-PVS转化受体菌TOP10获得了重组菌TOP10(pBAD-PVS),经阿拉伯糖诱导该重组菌表达出了46kDa的特异性融合蛋白,在Western blotting图谱上该蛋白与PVS特异性抗体(IgG)反应,呈现一条阳性杂交带,表明46kDa蛋白带是PVS-CP基因正确表达的产物。从重组菌中提取包涵体,包涵体经过4mol/L尿素洗涤后用超纯水4℃过夜溶解,所获溶液即为高纯度PVS重组CP水溶液,也就是说本研究建立了一种获得高纯度重组CP的非常简便的方法。

微小隐孢子虫重组蛋白CP23与CP15/60-23免疫原性的研究

目的探讨微小隐孢子虫重组蛋白CP23与CP15/60-23的免疫原性。方法用重组蛋白CP23与CP15/60-23分别免疫BALB/c小鼠,免疫3次,2w后检测抗CP23与CP15/60-23的特异性抗体IgG滴度、小鼠脾脏CD4+、CD8+T细胞及其培养上清中的细胞因子IFN-γ、IL-12,实验同时设PBS对照组;之后用微小隐孢子虫卵囊攻击免疫小鼠,收集小鼠粪便,计算小鼠排出的卵囊量。结果自免疫第2周特异性IgG抗体滴度水平逐渐升高,重组蛋白CP15/60-23组升高更为明显,免疫小鼠脾脏T细胞CD4+、CD8+百分比及CD4+/CD8+比值都增高,细胞因子IFN-γ、IL-12的水平亦增加,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);卵囊攻击后,各组小鼠粪便中的卵囊数量都很低,各组之间无明显差异。结论重组蛋白CP23和CP15/60-23皆可产生较好的细胞及体液免疫反应,具有较强的免疫原性。

cp23重组抗原用于微小隐孢子虫病血清学诊断价值的研究

目的探讨微小隐孢子虫cp23重组抗原(下称cp23重组抗原)在微小隐孢子虫病血清学诊断中的价值。方法收集112例腹泻患者粪便及血清标本,前者行抗酸染色法检测,后者分别应用微小隐孢子虫cp23重组抗原及卵囊全抗原ELISA法检测。结果两种抗原ELISA法检测的阳性率均略高于粪便检查结果,三者比较均无明显差异,并具有很好的一致性;有免疫缺陷者微小隐孢子虫cp23重组抗原ELISA法检测阳性率显著高于一般腹泻人群。结论微小隐孢子虫cp23重组抗原具有较高的敏感性,在相关疾病的免疫诊断中具有重要价值。

以CP23重组蛋白为抗原建立检测微小隐孢子虫抗体间接ELISA方法的研究

以在 E.coli高效表达的微小隐孢子虫子孢子表面抗原 CP2 3为抗原 ,以辣根过氧化物酶 (HRP)标记的山羊抗鼠Ig G为二抗 ,建立了检测微小隐孢子虫抗体的间接 EL ISA方法。经检测筛选出最佳反应条件为 1μg/孔纯化的 E.coli表达的CP2 3抗原包被酶标板 ,用 10 %兔血清进行封闭 ,以正常 E.coli裂解上清液稀释待检血清。实验表明应用 CP2 3重组蛋白作为诊断 C.parvum抗原具有特异性高。

微小隐孢子虫重组蛋白CP21的免疫特性

采用微小隐孢子虫CP21基因的原核表达蛋白的抗血清对微小隐孢子虫感染HCT-8细胞进行了体外阻断试验,检测不同浓度抗血清对HCT-8细胞感染隐孢子虫感染率的影响。同时应用纯化的重组CP21蛋白对小鼠进行免疫,检测体液免疫水平和细胞免疫水平的变化。对免疫后的小鼠接种微小隐孢子虫,检测重组CP21蛋白对微小隐孢子虫感染的保护效果。体外阻断试验结果显示,在培养基中分别加入1%、2%、5%和10%的抗重组CP21蛋白鼠血清时,HCT-8细胞感染隐孢子虫的平均感染率由82.0%分别下降到41.1%、35.2%、30.6%和23.5%;动物保护性试验体液免疫水平检测发现,试验组血清中IgG滴度随免疫次数增加而逐渐升高,第3次免疫后IgG滴度与对照组相比差异均极显著(P<0.01);细胞免疫水平检测证明CD4+/CD8+T淋巴细胞数值与对照组相比差异均极显著(P<0.01);攻虫保护试验结果表明试验组与对照组相比卵囊排出量显著减少(P<0.05),卵囊排出持续时间平均缩短4 d,减虫率达38%。体内外试验结果表明:CP21基因可用于作为预防和治疗隐孢子虫病的有效靶位点基因。

口蹄疫重组鸡痘病毒活载体疫苗vUTAL3CP1的构建与理化学特性研究

目的 构建含有口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体PI-2A和蛋白酶3C基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗并研究其理化学特性。方法选用鸡痘病毒作为载体，将FMDV的衣壳蛋白前体P1—2A和蛋白酶3C基因插入到鸡痘病毒表达载体中，构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL3CP1，并与鸡痘病毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞，通过药物BrdU加压筛选、间接免疫荧光实验以及Western blot等方法筛选并获得了一株重组鸡痘病毒。将其经酸、碱、加热、氯仿、乙醚以及胰蛋白酶处理，接种到CEF上观察处理前后口蹄疫重组活载体疫苗vUTAL3CP1细胞病变，分析这些理化因子对口蹄疫重组鸡痘病毒活载体疫苗vUTAL3CP1重组鸡痘病毒的影响。结果 在pH3．0～9．0范围内，pH值变化不会造成该口蹄疫重组活载体疫苗vUTAL3CP1毒价的显著变化；口蹄疫重组活载体疫苗VUTAL3CP1经50℃60min、55℃30min或60℃15min即可被灭活；对氯仿敏感；经胰蛋白酶37℃作用1h，毒价降低2．44log10TCID50对乙醚有抵抗力，经乙醚作用24h病毒滴度下降1．0log 10TCID50结论 筛选并鉴定了含有口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P12A和蛋白酶3C基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗vUTAL3CP1，为疫苗研制奠定基础。

马铃薯卷叶病毒与S病毒重组双CP多克隆抗体的制备

为了制备出马铃薯卷叶病毒(PLRV)与S病毒(PVS)重组双CP多克隆抗体并用于PLRV与PVS这2种病毒的间接与DAS-ELISA检测,构建了PLRV与PVS融合双CP基因的原核表达载体pET22b-LRCP/SCP,用超声破碎法代替溶菌酶法裂解重组菌BL21(pET22b-LRCP/SCP)并提取菌体蛋白,用镍离子亲和层析纯化获得了分子质量为51.2 ku的高纯度的重组双CP。用该重组双CP作抗原免疫家兔获得了高效价(1∶128 k)抗血清。纯化的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性标准物特异性结合,与另外4种马铃薯主要病毒(PVX、PVY、PVA与PVM)无交叉反应。间接ELISA反应中,稀释度为1∶3200的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性物都呈现阳性反应;在DAS-ELISA反应中,稀释度均为1∶100的重组双CP多克隆抗体及其碱性磷酸酶标记物与PLRV或PVS的阳性标准物也分别呈现阳性反应。结果表明,制备的重组双CP抗体既可用于PLRV与PVS这2种病毒的间接ELISA检测,也可用于DAS-ELISA检测。

甘薯羽状斑驳病毒和褪绿矮化病毒重组双CP融合基因的原核表达和抗血清的制备

由褪绿矮化病毒(SPCSV)和羽状斑驳病毒(SPFMV)协生共侵染引起病毒病(SPVD)是甘薯最严重的病害之一。为了建立一种高效的甘薯病毒病SPVD检测体系,本研究构建了SPCSV和SPFMV重组双CP基因的原核表达载体pET22b-SPVD-CP,该重组菌在20℃条件下经IPTG诱导,获得了68 kDa的融合蛋白(重组双CP)。利用高纯度重组双CP为抗原免疫家兔,获得了SPVD的抗血清,间接ELISA检测显示抗体稀释度在1∶512 K的范围内,制备的抗体与抗原具有较强的结合活性。本研究结果为利用重组CP作抗原大量制备SPVD抗体奠定了基础。

保定地区奶牛源微小隐孢子虫子孢子表面抗原Cp23免疫特性的研究

为了解河北省保定地区奶牛源微小隐孢子虫子孢子表面抗原Cp23的免疫特性,将重组质粒p ET28-Cp23表达产物纯化后免疫4周龄BALB/c小鼠,进行细胞免疫水平和体液免疫水平的检测。结果显示,试验组的CD4~＋/CD8~＋T淋巴细胞比值和Ig G水平增加明显,IL-12及IFN-γ的质量浓度亦都增高,与对照组比较均有统计学意义（P〈0.01）。结果表明,用重组蛋白Cp23免疫小鼠后可产生高水平的体液免疫和细胞免疫。本研究为保定地区隐孢子虫病的预防提供了材料。