重组Caspase-3基因的构建及其诱导胰腺癌细胞凋亡的观察

通过对 Caspase- 3(半胱氨酸蛋白酶 3)大亚基 (L S) ,小亚基 (SS)的重组 ,构建重组型 Caspase- 3基因 (r-caspase- 3) ,并探讨 r- Caspase- 3基因诱导胰腺癌细胞凋亡的可能性 ,以寻求肿瘤基因治疗的新途径。采用分子生物学方法克隆 Caspase- 3的大、小亚基 ,体外进行重新排列组合 ,使大、小亚基原来的排序颠倒 ,构建出 pc DNA3.1(+) / r- Caspase- 3真核表达质粒 ;利用脂质体瞬时转染人胰腺癌细胞 PC- ,RT- PCR检测 r- Caspase- 3m RNA的表达 ;流式细胞技术 (FCM)检测转染胰腺癌细胞凋亡状况。结果显示 :Caspase- 3的大、小亚基被完整克隆 ,r- Cas-pase- 3基因测序结果证实小亚基位于大亚基之前 ;RT- PCR扩增出 894 bp大小片段 ,流式细胞检测可见明显的凋亡峰出现。以上结果表明 ,重组 r- Caspase- 3基因其 m RNA可在胰腺癌细胞中表达并自催化诱导细胞凋亡 。

重组型Caspase-3基因的构建及其在胰腺癌细胞中凋亡活性的观察

目的 通过对半胱氨酸蛋白酶 3 (Caspase 3 )大、小亚基的重组 ,构建pcDNA3 .1(+ ) /r Caspase 3真核表达质粒 ,并探讨r Caspase 3基因诱导细胞凋亡的可能性 ,以寻求肿瘤基因治疗的新途径。 方法 采用分子生物学方法克隆Caspase 3的大、小亚基 ,并在体外进行重新排列组合 ,使大、小亚基原来的排序颠倒 ,构建出pcDNA3 .1(+ ) /r Caspase 3真核表达质粒 ;脂质体瞬时转染人胰腺癌细胞PC Ⅱ ,RT PCR检测r Caspase 3mRNA的表达 ;流式细胞技术 (FCM )检测转染胰腺癌细胞凋亡状况。结果 Caspase 3的大、小亚基被完整克隆 ,pcDNA3 .1(+ ) /r Caspase 3真核表达质粒测序结果证实小亚基位于大亚基之前 ;RT PCR扩增出 894bp大小片段 ,流式细胞检测可见明显的凋亡峰出现。 结论 构建的r Caspase 3其mRNA可在胰腺癌细胞中表达并自催化诱导细胞凋亡 ,可作为胰腺癌基因治疗的目的基因。

软骨发育低下患儿的临床特征及FGFR3基因变异分析

目的探讨软骨发育低下(hypochondroplasia,HCH)患儿的临床特征及成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor 3,FGFR3)基因变异特点。方法回顾性分析2015年1月至2021年10月空军军医大学第一附属医院收治的7例HCH患儿的临床资料、基因检测结果及重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)治疗效果。结果7例HCH患儿初始平均年龄为(6.4±2.7)岁(3.1~9.7岁),平均身高标准差分值为-3.22±1.22(-1.2~-4.9),上部量/下部量比值为1.28±0.13(1.10~1.52)。rhGH平均治疗时间为(4.4±1.2)年(3.1~6.0年),治疗后平均年龄为(10.8±2.1)岁(6.9~12.8岁),平均身高标准差分值为-1.73±1.32(-3.4~0.2),上部量/下部量比值为1.13±0.14(0.98~1.38)。HCH临床表现有不匀称身材矮小(7/7,100%)、肘关节伸展受限(2/7,28.6%)、腰椎前凸(2/7,28.6%)、轻度膝内翻(2/7,28.6%)、面部相对正常的前额凸起(1/7,14.3%)。HCH放射学特征包括长骨缩短伴轻度干骺端扩张(4/7,57.1%)、腰椎椎弓根间距变窄(1/7,14.3%)、短而宽的股骨颈(1/7,14.3%)、方形髋骨及扁平髋臼顶(1/7,14.3%)、坐骨大切迹变小(1/7,14.3%)。7例均存在FGFR3基因致病性变异,4例为FGFR3基因c.1620C>A(p.Asn540Lys)变异;3例为FGFR3基因c.1620C>G(p.Asn540Lys)变异。结论7例HCH均为FGFR3基因p.Asn540Lys的热点变异。HCH临床特征相对轻微,婴幼儿期需要加强认识和甄别。rhGH治疗对HCH患儿有效。

勘误:IL-33基因重组和表达不影响重组狂犬病病毒体外表型特征

因本文作者失误,发表在《细胞与分子免疫学杂志》2023年第39卷第7期第586-591页的“IL-33基因重组和表达不影响重组狂犬病病毒体外表型特征”的论文中,图1、图2C及图3C、3D用错了图片。投稿时由于疏忽,错误的使用了其他图片。经过反复核对和确认,现申请对图1、图2C及图3C、3D进行勘误,勘误结果与本文结论相符合,不影响文章的结果和结论。本文作者对该错误所造成的任何不便或误解,深表歉意。现将原图和更正后的图片附后。

携带EphrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体的构建和包装

目的:构建携带ephrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体,通过包装、扩增、鉴定,为后续开展目的基因靶向治疗乳腺癌研究奠定基础。方法:以pMD18T-Casp3、pMD18T-EphrinA1为模板扩增caspase-3、EphrinA1基因,以pET28a为载体,通过双酶切、连接、转化、测序鉴定,构建pET28a-EphrinA1-Casp3。然后以质粒pEC3.1(+)为载体,获得pEC3.1-EphrinA1-Casp3。采用LR体外同源重组,构建pAd-EphrinA1-Casp3,以HEK293包装和放大培养。结果:成功将PCR扩增的EphrinA1胞外端基因和人活性型caspase-3基因定向克隆入质粒pET28a,并将EphrinA1-caspase-3融合基因转移到穿梭质粒pEC3.1(+),获得pEC3.1-EphrinA1-Casp3载体;经过体外同源重组,成功构建携带EphrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-Casp3;并在HEK 293细胞中完成包装和扩增;获得重组腺病毒rAd-EphrinA1-Casp3。结论:利用GatewayTM技术成功构建重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-Casp3,经HEK293细胞包装,获得重组腺病毒rAdEphrinA1-Casp3。

肺癌组织 Caspase-3基因表达与细胞凋亡的关系(英文)

摘 要 :目的 研究 caspase- 3在肺癌中的表达并观察其与细胞凋亡的关系 .方法 免疫组织化学法检测 caspase- 3在肺癌组织中的表达 ,原位未端标记法 (terminal deoxynu-cleotidyl transferase mediated nick end labelling,TUNEL)检测细胞凋亡 .结果 肺癌细胞 caspase- 3表达呈现胞质染色 .6 2例肺癌中的 3 2例 (5 1 .6 % )不同程度的表达 caspase- 3 .检测肺癌中的细胞凋亡发现 ,3 8例肺癌表达高 TUNEL阳性率(6 1 .2 % ) ,2 4例表达低 TUNEL阳性率 ,高 TUNEL 阳性率与肺癌的淋巴结转移有关 (P=0 .0 0 7) ,并联系着较差的预后 .Caspase- 3的表达与肿瘤的分化 (P=0 .0 1 2 )和淋巴结转移 (P=0 .0 0 5 )有关 ,与患者的年龄、性别、分期及组织学类型无关 .肺癌组织中 caspase- 3的表达与肿瘤细胞的凋亡无明显关系 .Kaplan- meier生存曲线显示 caspase- 3阳性表达联系较好的预后 (P<0 .0 1 ) .结论 caspase- 3表达有重要的预后意义 。

Bcl-2蛋白及caspase-3基因表达与暴发性肝衰竭肝细胞凋亡关系的研究

目的:研究Bcl-2蛋白与caspase-3基因表达在实验性暴发性肝衰竭(FHF)中对肝细胞凋亡的作用。方法:用脂多糖和D-氨基半乳糖制备FHF小鼠模型;免疫组化法检测肝组织内Bcl-2蛋白表达;原位杂交法检测肝组织内caspase-3基因表达;缺口原位末端标记技术检测肝细胞凋亡。结果:模型组用药后2 h Bcl-2有较多表达,4 h表达最多,以后逐渐减少,4 h与2 h比较差别显著(P<0.05),与8 h、12 h比较差别十分显著(P<0.01)。模型组用药后2 h caspase-3开始少量表达,8 h达最高峰,并出现典型的肝细胞凋亡改变,12 h表达下降,且同时存在肝细胞凋亡和坏死。。Bcl-2与caspase-3表达及肝细胞凋亡均呈负相关。结论:在FHF中,肝细胞凋亡与caspase-3的激活有关;Bcl-2可能通过抑制caspase-3的活性而抑制肝细胞凋亡。

RNAi介导Caspase-3基因及其抑制LPS诱导肾脏上皮细胞凋亡的研究

目的:探讨RNA干扰Caspase-3基因及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的作用效果。方法:构建针对大鼠Caspase-3基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-Caspase-3shRNA,用电穿孔法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定的表达Caspase-3 shRNA的细胞系。实验分为3组:①正常对照组:未转染的RK3E细胞;②阴性对照组:转染空载体pRNAT-U6.1的RK3E细胞系;③实验组:转染Caspase-3 shRNA的RK3E细胞系。经脂多糖(LPS)孵育12小时后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR检测mRNA的表达,以及各组Caspase-8蛋白的活性。结果:与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低(P<0.01),Caspase-3的mRNA水平和蛋白活性显著降低(P<0.01)。结论:针对Caspase-3的特异性短发夹RNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的发生。

siRNA介导hPOT1基因表达抑制对HeLa细胞Caspase-3的影响

目的应用siRNA表达载体介导的RNA i技术,特异地抑制端粒保护蛋白POT1基因在HeLa细胞中的表达,并观察其对细胞Caspase-3活化的影响。方法利用作者课题组先前构建的含hPOT1基因特异性序列(hsDNA)的3种重组siRNA表达质粒(pmU6-shRNA1、pmU6-shRNA2和pmU6-shRNA3),由脂质体介导转染HeLa细胞,以RT-PCR和EM-SA法检测转染细胞中的hPOT1基因的表达抑制效果,并通过RT-PCR、W estern b lot和Caspase-3检测试剂盒分析Caspase-3表达和活化。结果3种pmU6-shRNA重组质粒转染HeLa细胞48 h后,细胞中hPOT1基因mRNA和蛋白质表达水平均降低,Caspase-3 mRNA表达水平基本无变化,Caspase-3酶原水平降低,而Caspase-3酶活性增高。结论siRNA表达载体介导的RNA i能有效地抑制HeLa细胞中hPOT1基因表达,hPOT1基因表达的抑制导致细胞Caspase-3活化。

大鼠肺鳞癌caspase-3基因表达水平与其细胞增殖关系的研究

目的 探讨caspase 3在大鼠肺鳞癌癌变转化过程中的表达及其与细胞增殖的关系。方法 Wistar大鼠 60只 ,其中 5 0只用化学致癌物 3 甲基胆蒽 (MCA)及二乙基亚硝胺 (DEN)碘油溶液于左肺叶支气管灌注诱发大鼠肺鳞状细胞癌 ,10只作为对照。应用免疫组织化学S P法检测促凋亡基因caspase 3和增殖细胞核抗原 (PCNA)在癌变过程中的表达。结果 3 4例大鼠肺鳞癌中 15例 (4 4 .12 % )有caspase 3的阳性表达 ,阳性系数为 1.3 8± 0 .95 ,均显著低于对照组大鼠支气管粘膜上皮细胞 (P =0 .0 0 7,P <0 .0 1)和癌前病变 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 5 )。对照组大鼠支气管粘膜上皮区、实验组大鼠癌前病变区与肺癌区PCNA的平均增殖指数 (PC NA LI)分别为 :14 .10± 5 .0 2、2 8.13± 8.72、41.88± 14 .2 4,两两比较 ,差异均有显著性 (P <0 .0 5 )。Caspase 3与PCNA LI呈显著负相关 (r =-0 .73 0 6,P <0 .0 1)。结论 Caspase 3失表达促进了肿瘤细胞的生长 ,可能在大鼠肺鳞癌的发生发展中起着重要的作用。联合检测caspase 3和PCNA蛋白可作为肺鳞癌癌变的主要参考指标。

应用GPV VP3基因重组原核表达产物建立检测抗体的ELISA方法研究

利用鹅细小病毒（GPV）VP3基因的原核表达蛋白作为包被抗原建立了检测GPV抗体的间接ELISA及Dot-ELISA方法。经确定两种方法的抗原包被浓度为125μg／mL，其中间接-ELISA 100μL／孔、Dot-ELISA 5μL／点。间接-ELISA中HRP标记的兔抗鹅IgG的工作浓度是1：200，检测血清的最适稀释度是1：400，阳性判定标准为OD492≥0．20，且P／N≥2．0。用此方法检测弱毒疫苗免疫血清，其抗体滴度在1：400～1：51200。Dot-ELISA的结果与间接-ELISA的结果一致。

槲皮素对急性心肌缺血大鼠心肌caspase-3基因蛋白表达的影响

为观察槲皮素对急性心肌缺血大鼠心肌细胞半胱氨酸蛋白酶 3 (caspase 3 )基因蛋白表达的影响 ,采用大鼠急性心肌缺血模型 ,应用免疫组织化学PAP法检测caspase 3基因蛋白的表达 ,并用图像分析系统进行定量分析。发现 :大鼠急性心肌缺血后心肌细胞caspase 3基因蛋白表达明显增强 ,槲皮素预保护可降低caspase 3基因蛋白的表达。提示 :槲皮素对急性心肌缺血损伤有保护作用 ,这种保护作用可能是通过抑制心肌细胞caspase 3基因蛋白的表达实现的。

大鼠脑缺血再灌流后神经细胞凋亡与caspase-3和caspase-9基因表达

目的:探讨大鼠局灶性脑缺血再灌流后神经细胞凋亡及其与caspase-3和caspase-9基因表达的关系。方法:应用原位末端标记和原位杂交技术分别观察细胞凋亡与caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表达。结果:脑缺血再灌流后,凋亡神经细胞主要分布于缺血半影区,随着时间的延长凋亡细胞数逐渐增加,至24 h达高峰。在缺血半影区,再灌流后神经细胞caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表达逐渐增强,到24 h阳性细胞数目最多,COD值最高,而缺血中心区两基因均弱表达。结论:脑缺血再灌流后神经细胞凋亡是一个动态的渐进过程。caspase-3和cas—pase-9基因表达在介导细胞凋亡过程中起重要作用。

嵌合重组caspase-3诱导表达促进肿瘤细胞凋亡

通过稳定转染人宫颈癌HeLa细胞 ,建立了野生型caspase 3(wt casp3) ,大小亚基序列颠倒的重组caspase 3(r casp3) ,和N端融合绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜肽段的嵌合重组caspase 3(cr casp3)的诱导表达细胞系 .蜕皮素诱导后细胞中检测到目的基因的表达 ,MTT检测和细胞计数结果表明 ,r casp3和cr casp3诱导表达后有效地导致HeLa细胞死亡 ,通过测定细胞中caspase 3活性 ,以及细胞周期检测、DNA梯状电泳条带检测(DNAladder)、电镜观察等证实r casp3和cr casp3诱导表达后细胞发生了凋亡 ,且二者的促凋亡活性相当 ,而wt casp3诱导表达细胞并未出现上述效应 .结果表明 ,与野生型caspase 3活化需要上游分子的切割不同 ,重组caspase 3具有自发的促凋亡活性 ,而N端PE肽段的融合不影响这种活性 ,因此PE转膜结构域和重组caspase 3有望参与构建能转膜进入细胞内部 。

大豆异黄酮对初老大鼠卵巢Bcl-2基因和Caspase-3基因mRNA表达的影响

目的观察大豆异黄酮(soy isoflavones,SI)对初老大鼠卵巢Bcl-2、Caspas e-3 mRNA表达及氧自由基含量的影响。方法利用自然衰老的雌性大鼠建立初老动物模型,连续灌胃给药8周后,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测卵巢Bcl-2和Caspase-3 mRNA表达,采用硫代巴比妥酸和黄嘌呤氧化法分别检测卵巢丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果与初老组相比,各SI处理组卵巢Bcl-2 mRNA表达量和SOD的活性均明显增高、Caspase-3表达量明显下降,中剂量(158 mg.kg-1)和高剂量(500 mg.kg-1)SI处理组MDA含量也显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论大豆异黄酮上调卵巢Bcl-2、下调Caspase-3表达、抑制氧自由基生成并增强SOD活性,可能是其改善衰老卵巢功能的机制之一。

非小细胞肺癌组织BAG-1和Caspase-3基因的表达及其关系

目的探讨BAG-1基因和Caspase-3基因在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其相互关系。方法应用免疫组织化学方法检测75例NSCLC组织细胞中BAG-1和Caspase-3基因的表达。结果在NSCLC组织细胞中,BAG-1基因表达率为64.0%(48/75),其表达与NSCLC TNM分期、淋巴结转移和细胞分化程度密切相关(χ2=5.16～5.36,P<0.05);Caspase-3基因表达率为57.3%(43/75),其表达与淋巴结转移密切相关(χ2=5.96,P<0.05);在NSCLC组织细胞中,BAG-1基因表达与BAG-1基因表达呈高度正相关(r=0.436,P<0.01)。结论在NSCLC组织细胞中,BAG-1基因表达上调,Caspase-3基因失活或低表达;BAG-1结合激活的Caspase-3,阻止细胞凋亡;BAG-1基因表达预示肺癌组织有较高的侵袭性和预后不良。

滑菇多糖对K562白血病细胞增殖的抑制及Caspase-3基因表达的影响

目的:研究滑菇多糖(PNP)的抗肿瘤作用及诱导K562细胞凋亡的机制.方法:采用MTT法检测PNP对K562细胞增殖的抑制作用;绘制生长曲线;Hochest33258染色计算凋亡率;RT-PCR法、Western Blot方法检测凋亡相关基因Caspase-3的表达.结果:MTT分析表明,PNP作用48h后可明显抑制K562细胞的增殖;Hochest染色结果显示,PNP能诱导K562细胞出现典型的凋亡形态,且凋亡率随多糖浓度增加而增大,经PNP100,200,400mg/L的处理后,凋亡率分别是对照组的3.15,6.55和8.62倍.PNP能诱导凋亡相关基因Caspase-3在 mRNA水平上的表达;Western Blot显示PNP能诱导Caspase-3编码蛋白的表达,且随多糖浓度的增加表达量增加.结论:PNP对K562细胞增殖有抑制作用,并能促进其凋亡;PNP通过诱导凋亡相关基因Caspase-3表达促进细胞凋亡.

MMC诱导EJ细胞凋亡和Fas/FasL、Caspase-3基因表达

目的:研究丝裂霉素(MMC)在体外诱导膀胱癌细胞EJ凋亡和凋亡相关基因Fas/FasL、Caspase-3表达的关系。方法:以低剂量MMC(0.100mg/ml)诱导EJ细胞凋亡;以TUNEL法和FCM研究EJ细胞凋亡、细胞周期分布及Caspase-3抗体对抗MMC诱导凋亡;以免疫组化检测Fas/FasL、Caspase-3蛋白表达。结果:低剂量MMC处理的EJ细胞出现明显的凋亡形态特征,凋亡峰和细胞生长阻滞均发生于G0/G1期,Fas/FasL、Caspase-3蛋白呈上调表达,Caspase-3抗体能特异性阻断MMC诱导EJ细胞凋亡。结论:低剂量MMC能够诱导EJ细胞凋亡和增加Fas/FasL、Caspase-3基因表达,且与启动Caspase凋亡信号传导有关。

重组禽呼肠孤病毒S1133σ3基因表达及其免疫原性研究

【目的】构建禽呼肠孤病毒(ARV)S1133σ3基因的真核重组质粒,研究其表达蛋白的免疫原性,为研发ARV基因疫苗奠定基础。【方法】采用RT-PCR对ARVS1133毒株的σ3基因进行RT-PCR扩增,扩增产物与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接后,转化大肠杆菌DH5α,然后提取重组质粒的DNA,经双酶切、PCR扩增鉴定和纯化。以阳性重组质粒pcDNA3.1-σ3免疫7日龄SPF雏鸡,同时设灭活S1133、表达σ3蛋白及生理盐水对照,二次加强免疫两周后,采用Westernblotting检测鸡群血清抗体;并用S1133毒株进行攻毒,4d后进行ARV检测。【结果】重组质粒pcDNA3.1-σ3的双酶切和RT-PCR扩增鉴定结果一致,均能扩增出约999bp目的条带;免疫攻毒试验结果表明,pcDNA3.1-σ3处理、灭活S1133处理、表达σ3蛋白处理和生理盐水处理的病毒检出率分别为7.4%、3.7%、11.1%和29.6%,pcDNA-σ3处理与生理盐水处理的差异显著(P<0.05),但与灭活S1133处理、表达σ3蛋白处理的差异不显著(P>0.05);病毒检出部位最高是关节,其次是胸腺和肾脏,胸腺检出率为零。【结论】真核表达ARVS1133σ3蛋白具有较好的免疫保护,可作为免疫抗原进行下一步的疫苗中和试验。