粉尘螨重组变应原Der f8的表达、纯化和免疫学鉴定

目的获得大量粉尘螨重组变应原Der f8蛋白,检测其免疫原性。方法合成粉尘螨第8组变应原(Der f8)基因,将其连接至pET-32a载体,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组Der f8蛋白,圆二色谱初步检测该蛋白二级结构,以粉尘螨过敏患者血清作为一抗,经免疫印迹法(Western-blotting)方法分析Der f8的免疫学特性。结果重组工程菌经IPTG诱导后,高效表达出Der f8蛋白,为可溶性蛋白。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量约为45ku。Der f8重组蛋白二级结构中,α螺旋34.5%,β折叠12.6%,无规则卷曲53.9%。表达产物经亲和层析纯化后,Western Blot印迹有明显条带显示。结论纯化后的Der f8具有较高的纯度和较强的免疫学活性,为粉尘螨过敏反应性疾病的特异性诊断和治疗及进一步的实验研究奠定了基础。

粉尘螨Ⅲ类重组变应原致敏的小鼠哮喘模型致敏效果分析

目的探讨粉尘螨Ⅲ类重组变应原(Der f 3)诱导的小鼠哮喘模型的致敏效果。方法 30只6～8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠随机分为PBS组(阴性对照组)、卵清蛋白(OVA)组(阳性对照组)和Der f 3组(实验组),OVA组和Der f 3组分别使用OVA和纯化Der f 3蛋白于第0、7、14d进行腹腔注射致敏,于第21d开始雾化吸入,连续7d,PBS组则换成PBS进行腹腔注射和雾化吸入。最后一次雾化吸入24h后,分别观察肺组织病理变化、支气管肺泡灌洗液(BLAF)中的白细胞计数,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定BLAF和脾细胞培养上清中IL-4、IL-2、IL-17和IFN-γ的含量及血清中IgG1、IgE抗体水平变化。结果 OVA组和Der f 3组小鼠肺部支气管、血管粘膜下及周围肺组织有明显的炎性细胞浸润、支气管上皮细胞部分断裂及脱落,血管壁明显水肿等,而PBS组未见明显病理改变;Der f 3组的BALF中白细胞总数[(19.99±1.03)×106个/mL]及嗜酸性粒细胞(EOS)[(1.81±0.07)×106个/mL]计数均明显高于PBS组(P<0.01);与PBS组相比:BALF中IL-4[(80.99±9.06)pg/mL]、IL-17[(209.69±31.86)pg/mL]呈高水平表达(P<0.01),而IL-2[(8.29±1.27)pg/mL]和IFN-γ[(55.04±18.85)pg/mL]含量则显著下降(P<0.01);上述指标在脾细胞培养上清中出现类似的变化。Der f 3组血清中IgE[(31.92±2.68)U/mL]、IgG1[(16.46±4.32)μg/mL]的含量表现为Th2型反应增强趋势;但OVA组和Der f 3组间所有指标差异均无统计学意义(P>0.05)。结论粉尘螨重组Der f 3蛋白可成功建立小鼠变态反应性气道及肺部炎症动物模型。