重组E.coli工程菌高密度培养生产人源型胶原蛋白

Several technical parameters were studied during the fermentation of recombinant E.coli for the production of collagen-like biopolymer.The effects of dissolved oxygen as well as glucose concentration on fermentation were observed.The OD 600 value could reach 98 when dissolved oxygen was controlled at 50% and glucose around 1%.The production of human-like collagen with a yield of 29.4% was obtained.

工程菌E.coli MM2的固定化细胞制备

固定化细胞技术是七十年代兴起的一门应用技术。固定化细胞具有细胞密度高、易进行连续生产且稀释率高、不易被污染、产物易分离、可降低设备规模等优点,已成为生物合成、生物转化的有效工具,得到广泛应用。近十年来,人们把固定化细胞技术应用到工程菌的培养中取得了一些有价值的结果。用工程菌制得的固定化细胞裂解青霉素生产6-APA,已达工业化生产水平。据文献报道,工程菌固定化后可大大提高重组质粒的稳定性,并且外源基因能稳定地表达。

高选择性基因工程菌E.coli SE5000生物富集水体中的镍离子

利用基因工程菌E .coliSE5 0 0 0对水体中的镍离子进行富集研究 .菌体细胞对Ni2 + 的富集速率很快 ,富集过程满足Langmuir等温线模型 .经基因改造的基因工程菌不仅最大镍富集容量与原始宿主菌相比增加了 4倍多 ,而且对pH值的变化呈现出更强的适应性 .对离子强度及其它共存重金属离子的影响的实验结果表明 :Na+ ,Ca2 + ,Cd2 + ,Pb2 + 的影响较小 ,但Mg2 + ,Hg2 + ,Cr3 + 和Cu2 + 所引起的负面效应较大 .金属螯合剂EDTA的存在对基因工程菌的富集行为影响很大 .

抗体夹心酶联免疫吸附法测定重组E.coli L-天冬酰胺酶及药代动力学研究

目的 建立大鼠血浆中重组E .coliL 天冬酰胺酶的抗体夹心酶联免疫吸附测定法 ,并进行药代动力学研究。方法 应用重组E .coliL 天冬酰胺酶免疫家兔 ,分离IgG ,用DEAE 纤维素柱色谱纯化 ,辣根过氧化物酶标记抗体 ,建立抗体夹心酶联免疫吸附法 ,测定大鼠血浆中重组E .coliL 天冬酰胺酶浓度。结果 方法的线性范围为 1～6 4U·L- 1 ,血药浓度与时间的关系符合二房室模型 ,初期和末端的T1 2 分别为 0 5 0～ 0 5 7h和 2 4 5～ 3 0 2h ,AUC与剂量成正比。结论 建立的抗体夹心酶联免疫吸附法在灵敏度、特异性、线性范围、精密度和回收率等方面 ,满足药代动力学研究要求。实验方法和重组E .coliL

重组血管紧张素转化酶抑制肽工程菌细胞破碎条件优化

以重组血管紧张素转化酶抑制肽（ACEIP）工程菌E.coli BL21（pGEX-4T-2-AHP）破碎率、破碎液中目的融合蛋白浓度（GST-AHP）为主要考察指标,对重组血管紧张素抑制肽工程菌破碎条件进行了优化。结果表明,其最佳工艺条件为每克湿菌体重悬于3 mL含有2 mmol/L EDTA的1×PBS缓冲液中,加溶菌酶至终浓度20 000 U/mL,室温放置30 min后超声破碎30 min,4℃10 000 r/min离心10 min取上清液。在此最佳工艺条件下破碎液中可溶性GST-AHP浓度达到1.83 g/L。

pBV-IL-6重组质粒构建及其在E.coli中的高效表达

目的构建人ＩＬ－６重组质粒（ｒｈＩＬ－６），并使其在Ｅ．ｃｏｌｉ中高效表达。②方法经计算机分析设计，人工合成３条寡核苷酸引物，通过定点诱变并优化起始区，应用ＰＣＲ扩增及重组ＤＮＡ技术，构建重组质粒ｐＢＶ－ＩＬ－６，并转化至Ｅ．ｃｏｌｉ宿主菌ＤＨ５α中诱导表达，对产物进行纯化和复性，ＭＴＴ法检测生物活性。③结果获得２种ｒｈＩＬ－６高效表达的Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α／ｐＢＶ－ＩＬ－６工程菌，一种表达２０．８ｋｕＩＬ－６全蛋白；另一种表达１６．８ｋｕ，Ｎ端缺失２５个氨基酸ＩＬ－６蛋白。薄层密度扫描分析表达产率，前者为２８．３％，后者为３３．４％，且均具有生物学活性。④结论ｒｈＩＬ－６构建成功。

重组E.coli胆固醇氧化酶的分离纯化及其酶学性质研究

对重组E.coli产生的胆固醇氧化酶采用70%硫酸铵盐析、CM Sepharose FF离子层析、Phenyl Sepharose 6 Fast疏水层析、Sephadex G-75凝胶过滤,得到的胆固醇氧化酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带,酶的纯化倍数为93,收率为21%。部分酶学性质表明:酶的最适反应温度为37℃,最适反应pH7.5,热稳定范围在40℃以下,酶的pH稳定范围为6～9,分子量分别为50 kD和52 kD。酶动力学参数Km值及Vmax分别为8.2×10-5mol/L和0.21 mmol/(L.min)。

抗体夹心酶免疫吸附法测定重组E.coli水蛭素HV3研究

将重组E. coli水蛭素HV3和BSA交联后免疫豚鼠和家兔,DEAE-纤维素柱层析纯化IgG.用这两种抗体和酶标二抗羊抗兔IgG-HRP建立三抗体夹心酶联免疫吸附法,测定重组E. coli水蛭素HV3的含量.本测定方法的线性范围为0～2 ng/ml,灵敏度为0.04 ng/ml.建立的三抗体夹心酶联免疫吸附法测定重组E.coli水蛭素HV3具有良好的精密度、回收率、灵敏度和特异性.

中国对虾素在大肠杆菌(Escherichia coli)中的重组表达

中国对虾素是从中国对虾血细胞中克隆得到的一种抗菌肽。为了进一步研究中国对虾素(CHP)的功能并为制备特异性抗体作准备,采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,进行了对虾素原核表达的研究。根据从中国对虾血细胞中克隆得到的对虾素基因设计特异性引物扩增中国对虾素成熟肽基因(Chp),插入原核表达载体pGEX4T1中,在E.coliBL21表达融合蛋白GSTCHP。结果表明,不同表达菌株的融合蛋白表达量为30%—34%,同一菌株在诱导5h后能达到最高表达量。利用GST亲和层析纯化融合蛋白,将融合蛋白用凝血酶裂解以得到CHP,其分子量约为5.6kDa,N端测序结果与期望的成熟对虾肽序列一致。用液体生长抑制方法检测活性,表明重组GSTCHP蛋白及CHP均表现出对大肠杆菌的抑菌活性。

大肠杆菌E.coli HB101(pBR322)高密度培养过程质粒的稳定性

通过正交实验考察了大肠杆菌E.coli HB101-pBR322)高密度培养过程中，不同培养条件对质粒的稳定性和β(内酰胺酶活力的影响. 结果表明，当温度在33(39oC、pH为6.4-7.2、DO为 40%-80%、 补料速率在5.4-10.8 g/h范围内变化，以及细胞密度达到27.3 g/L、比生长速率达到0.73 h-1时，质粒没有发生丢失现象，但在培养过程中β-内酰胺酶的活力降低.

生长速度对β干扰素工程菌稳定性和产物表达的影响研究

为了研究发酵培养阶段生长速度对重组人干扰素 β(hIFN β)工程菌稳定性、菌体密度和干扰素表达的影响 ,采用日本LE .MarubishiMSJ 5 0L发酵罐 ,在发酵过程中于诱导后通过控制不同的补料速度 ,检测低和高生长速度及发酵结束后菌体密度、稳定性和重组人干扰素 β的表达量。诱导后维持低生长速度 ,发酵结束后平均密度A60 0 值为7.5 2 ,表达量达 2 0 .7% ,质粒稳定率好 ,达到 91% ,粗制干扰素收获 2 .37克 ;维持高生长速度 ,发酵结束后平均密度A60 0 值达 2 0 .5 7,而表达量降为 4 .13% ,质粒稳定率降为 2 7% ,粗制干扰素收获仅为 0 .5 9克。

E·coli L-天冬酰胺酶B细胞抗原表位氨基酸残基Lys^(196)对其抗原性的影响

目的:研究重组E.coli L-天冬酰胺酶B细胞抗原表位中关键氨基酸残基对其抗原性的影响。方法:以Ala为替代残基,对抗原表位192TPARKHTS199中Lys196进行PCR定点突变,双向免疫扩散法和间接ELISA法分析新型重组E.coli L-天冬酰胺酶的抗原性。结果:采用双向免疫扩散法和间接ELISA法检测,与重组E.coli L-天冬酰胺酶相比,新型重组E.coliL-天冬酰胺酶与重组E.coli L-天冬酰胺酶抗体结合率下降64%。结论:通过对重组E.coli L-天冬酰胺酶B细胞抗原表位关键残基的定点突变有效地降低了其抗原性。

基因工程菌的发酵及偶氮染料脱色研究

考察了本实验室自行构建的基因工程菌pGEX-AZR/E.coliJM-109的培养条件(碳源、氮源及其量的选择,接种量、温度、pH值);并考察其偶氮染料脱色能力范围。

编码弓形虫表面抗原P30基因的克隆及在E.coli中的表达

目的 构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因重组表达质粒 ,初步观察P30基因在E coli表达。方法 将P30基因定向克隆到分支杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒热休克蛋白 70 (hsp70 )起动基因的下游的多克隆位点 ,构建重组表达质粒pBCG -P30 ;采用亚克隆技术 ,将含P30和hsp70起动基因的复合片段 ,插入表达载体 pBK -CMV质粒 ,转化大肠杆菌DH5α ,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒 pBK -P30转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达后进行SDS -PAGE和Westernboltting分析。 结果 1)阳性重组质粒 pBCG -P30、pBK -P30经酶切和PCR鉴定 ,与预期的结果相符合。 2 )序列测定证实克隆的基因为编码P30抗原的基因。 3)P30基因在大肠杆菌诱导表达后获得4 5kDa融合蛋白 ,此抗原未被弓形虫高免兔血清识别。结论 成功构建编码弓形虫表面抗原P30重组表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得表达 。

人胰岛素原在基因工程菌中的高效表达

目的 构建RRhPI-pQE4. 0E .coliM15表达系统 ,以高效表达 (His) 6 -Arg -Arg -人胰岛素原。方法 正交法优化发酵条件 ,通过湿菌体收率、包涵体收率及发酵液A60. 0 的测定对优化结果进行评估 ,并进一步分析发酵过程中主要因素对高密度发酵和高效表达的影响。结果 发酵条件优化后 ,每升发酵培养基可得湿菌体约 4 3g ,包涵体约 14g(湿重 )。结论 优化发酵条件可使湿菌体及包涵体的收率提高。

利用细胞工程技术改造重组蛋白生产用CHO细胞的研究进展

重组蛋白产品，即通过 DNA重组技术使目的基因在相应宿主细胞中表达所获得的蛋白产品。其中，E.coli 源的占42%，酵母源的占21%，中国仓鼠卵巢（Chinese hamster overy，CHO）细胞源的占29%。而在与治疗和预防相关的重组蛋白中，CHO细胞源的已近70%[1]。

应用SDS-PAGE技术分析重组蛋白的聚集性

应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳技术分析重组蛋白质的表达水平以及纯化的结果时,发现其结果可以判定重组蛋白质的聚集状况,对聚集产生的原因及意义进行了讨论。

产胆固醇氧化酶重组大肠杆菌的发酵培养基和诱导条件的优化

在摇瓶中对产胆固醇氧化酶重组大肠杆菌的发酵培养基和诱导条件进行了优化,优化培养基为甘油10 g/L,胰蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,KH2PO42 g/L,K2HPO44 g/L,Na2HPO4.12 H2O7 g/L,(NH4)2SO41.2 g/L,NH4Cl 0.2 g/L,MgSO4.7 H2O1 g/L;优化的诱导条件为:对数生长中期诱导,IPTG浓度为0.3 mmol/L。在优化的培养基和优化的诱导条件下,单位菌体产酶量达745.86 U/g,菌体产酶水平达1 625.97 U/L,为优化前的700 U/L的2.3倍。

产腈水合酶重组大肠杆菌的质粒稳定性研究

成功构建了腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)高表达的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETNHM(Kanr),研究了重组质粒pETNHM在重组菌株中的质粒稳定性。结果表明,pETNHM具有较好的结构稳定性,连续传代60代后质粒的基因序列没有明显缺失,且能够正常表达腈水合酶。pETNHM具有分离不稳定性,在无抗生素选择压力下,连续传代48代后质粒丢失的无质粒细胞开始出现。琼脂糖凝胶电泳定量分析表明,2/3的质粒pETNHM以二聚体形式存在,导致质粒拷贝数的下降。进一步研究表明,重组细胞的连续高速分裂及腈水合酶的高表达也会造成质粒拷贝数的下降,从而降低其分离稳定性。反之,重组菌株相对于宿主菌株的较高比生长速率有利于保持含质粒细胞的生长优势,卡那霉素的选择压力则能够保证质粒的稳定遗传。

生物转化法生产茶氨酸的重组大肠杆菌的构建

为构建生物转化法生产茶氨酸的基因工程菌,作者分析了影响大肠杆菌高效表达γ 谷氨酰基转肽酶的几个主要因素.将大肠杆菌 JM109 的 ggt基因接入两种不同的质粒中后,转化大肠杆菌JM109,并在一定的条件下进行表达.通过对比 E coli JM109 和转化子的γ 谷氨酰基转肽酶表达活性的不同,探讨了ggt基因的拷贝数、启动子的强弱等几个因素对γ 谷氨酰基转肽酶高效表达的影响.实验表明,将含有自身信号肽和启动子的 E coli JM109 的 ggt基因接入高拷贝的质粒pUC18中,仅提高 ggt基因的拷贝数不能增加γ 谷氨酰基转肽酶的表达量.将含有自身信号肽但不含有自身启动子的E coli JM109的ggt基因接入具有 tac启动子的表达载体 pEtac中,发现在强启动子tac的控制下,γ 谷氨酰基转肽酶的表达量提高至出发菌株的 2 3 倍.将构建的工程菌用于生物转化法生成茶氨酸,底物转化率相应地提高至出发菌株的1 7倍.