重组腺相关病毒介导RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞影响的动物试验

目的探讨EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP-1)对于鼻咽癌细胞在体内增殖及转移能力的影响。方法设计针对EBV-LMP-1的特异性发夹状RNA(shRNA)干扰序列,构建2种重组腺相关病毒(rAAV)载体:(增强型绿色荧光蛋白,EGFP)rAAV-EGFP和rAAV-shRNA-LMP-1,以不同滴度rAAV-EGFP转染鼻咽癌C666-1细胞确定最佳转染复数(MOI),rAAV-shRNA-LMP-1按MOI转染C666-1,RT-PCR鉴定抑制效率,将体外转染RNA干扰后的C666-1细胞注入裸鼠肝脏包膜下制作鼻咽癌异位肝种植的肝肺转移模型,观察肝脏成瘤及肝内、肺转移情况,分析LMP-1基因沉默在动物水平对鼻咽癌细胞成瘤及转移能力的影响。结果rAAV-EGFP以5×104v.g(virus genome,病毒基因组数)/细胞转染C666-1细胞,转染效率大于95%,RT-PCR鉴定rAAV-shRNA-LMP-1以5×104v.g/细胞转染C666-1后目的基因抑制效率大于90%,动物试验结果显示rAAV-shRNA-LMP-1组肝脏成瘤体积与对照组rAAV-EGFP无显著差异,但显著减少了种植肿瘤的肝内及肺转移率。结论通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP-1基因表达,可在动物水平抑制鼻咽癌细胞转移,但对鼻咽癌细胞生长无显著影响。

EB病毒潜伏膜蛋白2重组腺病毒的构建及其免疫效果的研究

为了进一步研究以EB病毒潜伏膜蛋白2穴LMP2)为靶抗原制备EB病毒相关肿瘤的治疗性疫苗,利用AdEasy系统构建了EBV鄄LMP2的重组腺病毒。PCR鉴定结果证实病毒DNA中含有目的基因的特异性片段;RT鄄PCR证明了外源基因在真核细胞中得以转录;免疫酶和Westernblot的结果也显示LMP2蛋白在真核细胞得到表达。将扩增后的病毒感染Hela细胞测定病毒滴度为1.5×109pfu/ml。将重组病毒以灌胃、肌肉注射和滴鼻的方式感染小鼠,经免疫荧光检测其特异性抗体,LDH法检测特异性CTL的杀伤作用,结果发现三种给药途径均可诱发小鼠针对LMP2的特异性体液免疫和细胞免疫,而用Ad5作为对照组的小鼠则没有引起相应的免疫反应。该研究将有益于进一步探索抗肿瘤特异性主动免疫作用在阻止肿瘤的生长、扩散或复发中的作用。对诱导机体产生特异性抗瘤活性有重要意义。

EB病毒衣壳蛋白P23重组质粒的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的构建pPICZαA-BLRF2重组表达载体,实现BLRF2重组蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达,为进一步研制高效能重组抗原诊断试剂,研发亚单位疫苗奠定基础。方法以B95-8细胞提取的EBV DNA为模板,采用PCR法扩增出目的基因片段BLRF2,与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,电转化酵母菌GS115,甲醇诱导重组蛋白表达,表达产物经Western blotting进行鉴定。结果成功构建pPICZαA-BLRF2重组质粒,并在毕赤酵母菌中成功表达了分泌型BLRF2重组蛋白。结论在毕赤酵母GS115中高效分泌表达了P23蛋白,获得了在鼻咽癌筛选中有一定应用价值的pPICZαA-BLRF2生产酵母工程菌株,为进一步应用研究奠定了基础。

去除致癌基因的EB病毒潜伏膜蛋白1的重组腺病毒的构建及其免疫效果

为进一步研究利用EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)进行免疫治疗的可行性,构建了含有去除致癌基因的EB病毒LMP1片段(LMP1△)的穿梭质粒pAdTrack CMV LMP1△,将它与腺病毒骨架质粒pAdEasy 1用电转染的方法共同导入大肠杆菌BJ5183中,在宿主菌重组酶的介导下进行同源重组。通过抗性筛选,获得含有重组腺病毒基因的质粒;然后再通过脂质体将重组腺病毒质粒导入腺病毒包装细胞HEK293细胞中,在HEK293细胞E1蛋白的反式作用下,病毒被包装。将包装病毒的细胞裂解上清进行PCR鉴定证实,病毒DNA中含有目的基因的特异性片段。RT PCR证明了外源基因在真核细胞中得以转录,免疫酶和Westernblot的结果也显示,LMP1△蛋白在真核细胞得到表达。将扩增后的病毒感染HeLa细胞,测定病毒滴度为3.0×109PFU/ml。为初步探讨其免疫效果,采用肌肉注射和滴鼻的方式感染Balb/c纯系小鼠,免疫酶检测其特异性抗体,LDH法检测特异性CTL的杀伤作用,结果发现,两种免疫途径均可诱发小鼠针对LMP1的特异性体液免疫和细胞免疫,而且Ad5作为免疫对照组的小鼠则没有引起相应的免疫反应。

鼻咽癌病人血清抗重组EB病毒Zta抗原IgG抗体检测

目的:用免疫印迹法检测鼻咽癌病人血清中抗EB病毒Zta-IgG抗体。方法:利用含EB病毒BZLF1基因完整开放读框的pGEX2TK-ZcDNA质粒转染大肠杆菌,诱导产生并提纯重组基因产物GST-Zta,以GST-Zta作为抗原,用免疫印迹法检测24例鼻咽癌病人血清中Zta-IgG抗体,28例正常人血清作为对照。结果:鼻咽癌组血清中91.7%Zta-IgG阳性,对照组中10.7%Zta-IgG阳性,两组差异有统计学意义(P=0.000)。结论:免疫印迹法检测鼻咽癌病人血清中Zta-IgG抗体有较高的敏感性和特异性,可能可以作为鼻咽癌病人诊断筛选的指标。

EBV-LMP2重组腺病毒体内细胞免疫效果及分布研究

背景与目的 EB病毒(EBV)潜伏膜抗原2是预防和治疗EBV相关肿瘤的良好靶抗原,本研究以食蟹猴为研究系统,观察携带EBV潜伏膜抗原2基因(LMP2)的重组5型腺病毒(Ad-LMP2)在动物体内引起的细胞免疫应答及病毒载体分布。方法分别使用低、中、高不同剂量的Ad-LMP2,于0周、4周以肌内多点注射的方式免疫食蟹猴,应用流式细胞仪检测动物外周血CD3、CD4、CD8阳性T细胞的比值;γ干扰素酶联免疫斑点法(IFN-γ-ELISPOT法)检测Ad-LMP2诱导的LMP2特异性CTL;RT-PCR方法检测首次和末次注射后,不同时间点外周血中重组病毒的载量,以及8周后,脑、心、肺、肝、脾、肾、睾丸、卵巢和注射局部肌肉的基因分布情况。结果与同期对照组或免疫前比较,Ad-LMP2免疫的动物外周血T淋巴细胞亚群未见差异(P>0.05);低、中、高不同剂量都能够诱导产生LMP2特异性CTL,其中,中、高剂量组反应水平较高;Ad-LMP2肌内注射后15min～1h在血中浓度最高,2～8h后分布到其他脏器。1d后,病毒主要分布在注射局部的肌肉组织中,而在脑、心、肺、肝、脾、肾、卵巢或睾丸等组织内,未检测到重组病毒。结论 Ad-LMP2在食蟹猴体内能够诱导产生LMP2特异性CTL,对T淋巴细胞亚群不产生影响,重组病毒只分布在注射局部肌肉,没有潜在危险。

不同时间EBV-LMP2重组腺病毒体内细胞免疫效果研究

目的观察携带EB病毒(EBV)潜伏膜抗原2基因(LMP2)的重组5型腺病毒(Ad-LMP2)免疫Balb/C小鼠后,不同时间点的免疫反应。方法每只小鼠通过肌内注射的方式免疫2×109VP的Ad-LMP2重组病毒颗粒,使用γ干扰素酶联免疫斑点检测方法(IFN-γELISPOT),分别于免疫后1、2、3、4、5周检测小鼠脾淋巴细胞中,LMP2特异性释放IFN-γ的细胞数。观察不同时间点特异性CTL反应强度的变化。结果 Ad-LMP2免疫小鼠1周时,就已经产生明显针对LMP2的特异性CTL,1×106个小鼠脾淋巴细胞中,可以检测到约800个特异性释放IFN-γ的细胞。随着时间的延长,与1周时的结果相比CTL水平2、3、4周均没有明显改变,5周时稍有下降(P<0.05)。结论 Ad-LMP2免疫Balb/C小鼠,1周内就能够诱导出LMP2特异性CTL,产生的CTL能够稳定存在。

EB病毒包膜糖蛋白gp85真核表达载体的构建

用基因工程技术克隆EB病毒中抗原性较强的膜蛋白gp85的编码基因BXLF2,构建真核表达载体。以EB病毒B95-8细胞培养上清为模板,PCR扩增出BXLF2基因。PCR产物经SnaBⅠ和NotⅠ双酶切后克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,用双酶切和DNA测序鉴定重组质粒。重组质粒双酶切的片段大小与预期符合,重组克隆外源基因的测序结果与文献报道一致。结果表明,EB病毒gp85的编码基因BXLF2被成功地克隆入真核表达载体pPIC9K,为下一步在毕赤酵母中表达EB病毒gp85蛋白建立了基础。

EBV编码潜伏膜蛋白2A抗原表位的串联表达及其免疫原性分析

目的:制备具有免疫原性的EB病毒潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)的表位串联蛋白并分析其免疫学特性。方法:用DNAstar软件分析LMP2A的抗原表位,将预测的免疫原性较强的两个表位通过基因合成串联在一起,克隆到原核表达载体pET28a中,经大肠杆菌BL21表达并纯化。制备的含LMP2A表位重组蛋白经SDS-PAGE、Western blot鉴定后,免疫小鼠制备多克隆抗体,以ELISA检测抗体的效价,免疫组织化学法检测该抗体对天然LMP2A的特异性。结果:通过原核表达与纯化,获得高纯度的表位融合蛋白,经小鼠免疫并制备效价高且特异性的小鼠抗LMP2A的多克隆抗体,该抗体可用于ELISA和免疫组织化学分析。结论:本研究制备的表位融合蛋白,具有天然抗原的免疫原性,可制备能特异性识别天然LMP2A分子的多克隆抗体,为利用表位融合蛋白筛选全人源基因工程抗体奠定了基础。

EB病毒壳抗原、核心抗原重组蛋白的制备及在鼻咽癌血清学诊断中的应用

目的探讨EB病毒（EBV）壳抗原（VCA）-BFRF3和核心抗原（NA）1—BKRF1重组蛋白在鼻咽癌（NPC）血清学诊断中的应用。方法以EBVDNA为模版，用PCR扩增目的基因BFRF3和BKRF1，插入大肠杆菌表达载体pET．51b后转染大肠杆菌JM109，诱导重组蛋白表达。表达产物经SDS—PAGE、免疫印迹分析鉴定，金属螯合亲和层析纯化后，分别制备用BFRF3、BKRF1及BFRF3／BKRF1作为包被抗原的ELISA试剂，检测NPC患者和正常人群EBV—I外抗体。结果大肠杆菌高效表达BFRF3和BKRF1重组蛋白，表达产物相对分子质量分别为20000和29000，均有良好免疫反应性；BKRF1的NPC诊断灵敏度（71．20％，178，250）明显高于BFRF3（64．80％，162／250）（P〈0．01），但两者NPC诊断特异性差异无统计学意义（P〉0．05）。相对于单独应用1种抗原，联合2种重组抗原的方法诊断NPC具有高灵敏度（84．80％，212／250）和相对低的特异性（82．00％，328／400）俨〈0．01）。结论NA1-BKRFI诊断NPC的灵敏度高于VCA—BFRF3，两种抗原联合使用，可提高诊断灵敏度，但特异性明显降低。

用重组EB病毒蛋白诊断鼻咽癌

检测EB病毒(EBV)抗原的免疫学反应可诊断鼻咽癌。目前的检测方法是使用EBV感染的类成淋巴细胞产生的EBV抗原,但该病毒在这些细胞中很难复制。本文报道用Western印迹法、免疫荧光法及酶联免疫吸附测定(ELISAs)法,以重组杆状病毒或牛乳头病毒产生的EBV密码碱性DNase、胸苷激酶及膜抗原(gp340/220)等3种病毒蛋白检测鼻咽癌患者血清中反应性IgG及IgA抗体的存在。检测具体方法以前曾有报道。使用的抗血清标本取自30例EBV血清阳性(VCA+)

建立产生gfp报道基因重组EB病毒细胞株

目的 建立产生带有gfp报道基因的重组EB病毒株。方法 构建一个有EBVDNABamHⅠ的C和H片段、gfp报道基因和puromycin选择基因的真核细胞穿梭质粒 (pGFPUROEB) ;采用电穿孔法将其转染于B95 8细胞中 ,并用荧光显微镜和流式细胞仪检测gfp的表达 ,PCR及Southernblot检测重组gfpEB病毒基因。结果 经puromycin的长期筛选 ,建立 80 %以上表达gfp的B95 8细胞株 (称gfpB95 8) ,PCR检测有gfp基因 ;经Southernblot检测证实gfpB95 8可产生重组gfp的EB病毒。结论 构建了gfp报道基因和puromycin选择基因的真核细胞穿梭质粒 ;并成功建立产生带有gfp报道基因的重组EB病毒株。

EB病毒包膜糖蛋白gp85真核表达载体的构建

Epstein-Barr病毒（EBv）属疱疹病毒r亚科嗜淋巴细胞病毒属的DNA病毒。该病毒感染与我国南方的鼻咽癌关系密切，是重要的肿瘤相关病毒。EB病毒穿入B细胞需要3种糖蛋白复合物gp85-gp25-gp42的参与，穿入上皮细胞需要gP85-gp25复合物的参与，gps5缺陷的EB病毒不能穿入B淋巴细胞或粘附上皮细胞。gp85在病毒的吸附和穿入靶细胞中起重要作用。是抗EB病毒感染的重要靶抗原，因此克隆并表达EBV的膜蛋白抗原片段gp85。对研究EBV的某些生物学特性有着重大作用。本文把EBV膜糖蛋白抗原性较强的gp85膜外区的编码基因BXLFR，克隆至pPIC9K质粒。构建毕赤酵母表达系统的重组质粒。

人IL-2与EB病毒LMP1融合基因重组BCG的构建与表达

目的构建并鉴定人IL-2与EB病毒LMP1融合基因重组BCG(卡介苗)。方法利用RT-PCR从EB病毒阳性的B95-8细胞中获得去除致癌部分的LMP1基因,与扩增的IL-2通过overlap-PCR扩增获得融合基因。将融合基因连接到穿梭表达质粒pMV261,进行酶切、PCR及测序鉴定。重组质粒经电转导入BCG,通过Western blot鉴定目标抗原在rBCG中的表达。结果 PCR扩增获得453bp IL-2和1 225bp LMP1,利用overlap-PCR获得1 623bp的融合基因,通过电转仪将重组质粒导入BCG感受态细胞,构建的重组质粒能够在BCG中表达相对分子质量为5.7×104的目的蛋白,Western blot显示该蛋白能被兔IL-2单抗及鼠LMP1单抗识别。结论构建的rBCG能稳定表达融合蛋白,为rBCG的抗肿瘤作用和抗肿瘤疫苗的研发奠定了基础。

一组单克隆抗体对杆状病毒表达的EB病毒gp350的识别是构象依赖性的

一组单克隆抗体对杆状病毒表达的ＥＢ病毒ｇｐ３５０的识别是构象依赖性的［英］／［ＺｈａｎｇＰＦ．．．ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ．－１９９３，７４．２１７１～２１７９］ＥＢ病毒（ＥＢＶ）的主要膜蛋白ｇｐ３５０能够诱导在体外中和病毒的感染性的抗体，是ＥＢＶ疫苗的－...